第二章基因工程制药-1PPT.ppt

基因工程制药;目的要求 ;学习内容;知识回顾;第一节 基因工程制药概述;Question :为什么将基因工程技术引入制药领域？ 传统制药存在的问题： A、材料来源困难或制造技术问题而无法付诸应用； B、从动物脏器中提取出来，也因造价太高，或因来源困难而供不应求； C、由于免疫抗原等缘故，使它们在使用上受到限制。;基因工程技术就是能够十分方便、有效地生产许多以往难以大量获取的生物活性物质，甚至可以创造出自然界中不存在的全新物质。;基因工程技术的应用特点： A、为癌种、病毒性疾病、心血管疾病和内分泌疾病的预防、治疗和诊断提供新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。 B、基因工程技术的最大好处在于它能从极端复杂的机体细胞内取出所需要的基因，将其在体外进行剪切拼接、重新组合，然后转入适当的细胞进行表达，从而生产出比原来多数百、数千倍的相应的蛋白质。;a. 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质，为临床使用提供有效的保障； b. 可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围； ;c. 利用基因工程技术可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； d. 内源性生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造； e. 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。;第二节 基因工程药物生产过程;;1、基因克隆载体:质粒载体， 2、重组DNA技术的有关工具酶及其应用 3、核酸制备技术： 制备纯净、高质量的 载体DNA和待克隆的核酸，才能有效地进行后续的酶切、反转录、连接等分子克隆操作。;主要包括: 工程菌大规模发酵最佳参数的确立 新型生物反应器的研制 高效分离介质及装置的开发 分离纯化的优化控制 高纯度产品的制备技术 生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造 计算机的优化控制等。;基因工程药物制造的主要步骤;第三节 目的基因的获得; 逆转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。 1、mRNA purification 细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离困难。 但是mRNA的3’末端常含有一poly A组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于Oligo-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。;;2、cDNA第一链的合成：寡聚脱氧胸苷酸为引物，逆转录酶催化，合成互补DNA。 3、cDNA第二链的合成：除去mRNA， cDNA第一链为模板。 4、cDNA cloning：expression vector pUC 5、将重组体导入host cell 6、cDNA library identification 7、目的cDNA 克隆的分离和鉴定 （限制酶图谱的绘制、杂交分析、基因定位、基因测序、 确定基因的 转录方向、转录起始点等。）;Polymerase chain reaction 的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚。通过针对这两个已知区域的DNA引物，在Taq酶催化下，进行2n指数递增方式的扩增，获得大量的DNA片段。;RT-PCR;5?;Cycle 3;RT-PCR;较小的蛋白质和多肽的编码基因可以用人工化学合成法获得。 化学合成法有个先决条件是：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA的碱基系列。 ;方法： 合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。;各代表什么 氨基酸？;人工化学合成基因的限制： a. 不能合成太长的基因。最长50-60bp.只适用于克隆小分子肽的基因。 b. 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难，如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完全一致，易造成中性突变。 c. 费用太高。 ;小结;思考题