第二章 基因工程酶学基础PPT.ppt

基因工程概念;第二章 基因工程的酶学基础;工具酶;核酸水解酶类;主要工具酶;第一节 　限制性核酸内切酶 第二节 　DNA连接酶 第三节 　DNA聚合酶和反转录酶 第四节 　DNA 修饰酶 ;第一节 限制性核酸内切酶;限制性内切酶 Restriction enzymes (分子手术刀);主要来源于原核生物;早在上世纪60年代Linn和Arber在研究噬菌体的寄主范围时发现如下的现象： 分别在E. coli的K菌株和B菌株上生长的λ噬菌体（称λK和 λ B ）能高效感染各自的宿主; 但用λK感染B菌株或用λ B 去感染K菌株则感染率会大大降低，这就是限制。 如果一旦λK感染B菌株成功则在B菌株中形成的后代也就能高效感染B菌株，再也没有限制现象， 这个现象称为修饰。 限制和修饰是由宿主控制的，故称为宿主控制的限制和修饰作用。;限制;现已从各种微生物中发现与鉴定出3800余种限制-修饰系统，其中有限制性内切核酸酶3819个、甲基转移酶844个。现已商品化的限制酶624个，甲基转移酶32个。; I 型限制性内切酶; 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离 第一个酶是Hind Ⅱ，其次是 Hind III。;III类限制性内切酶 ;2.限制性内切核酸酶的命名;1）识别序列的特异性;;2）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能;3）切割位点的特异性;;平齐末端的特点;不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。;;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等;同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。;6、影响限制性内切酶活性的因素;大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。;4）DNA分子的构型;是影响限制酶活性的重要因素;如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。; 诱发星（*）活性的原因;8、限制性内切酶对DNA的消化;1）DNA分子的单酶切;2)DNA分子的双酶切消化;基因工程中一般使用双酶切;3）完全酶切消化与不完全酶切;9、酶切反应的终止;10、酶切反应的操作过程;10. Ⅱ型限制性内切酶的主要用途;;方法1：单酶切;如何鉴定单酶切连接产物方向;方法2：部分酶切（双酶切）;EcoR I;方法3：同尾酶（双酶切）;;第二节 DNA连接酶;2、DNA连接酶的性质;DNA连接酶催化的连接反应特点： ;3、常用的DNA连接酶;4、DNA连接酶作用机理;5、影响连接反应的因素; T4DNA连接酶的活性一般用Weiss单位来衡量，即37℃条件下20min内可使1nmol/L32P在有机焦磷酸与ATP之间产生交换的酶量为1个活性单位。 黏性末端连接酶浓度0.1单位以上即可，而平末端连接可能需要1-2个活性单位。 反应时间，在16 ℃时，4h即可，而在4 ℃时则需连接过夜。;3）ATP浓度; 相同的分子末端间存在竞争，形成不同构型的DNA分子（自身环化、线形多聚体、环化多聚体以及重组质粒）。 分子越小、浓度越低越容易形成自身环化；另要注意载体与目的DNA浓度之比。;从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。;7、DNA连接的反应体系;第三节 DNA聚合酶;1）共同特点;;3→5外切酶活性──校对作用：这种酶活性的主要功能是从3→5方向识别和切除不配对的DNA生长链末端的核苷酸。当反应体系中没有反应底物dNTP时，由于没有聚合作用而出现暂时的游离现象，从而被3→5外切酶活性所降解。当向反应体系加入dNTP，而且只加放与模板互补的上述核苷酸才会使这种外切酶活性受到抑制，并继续进行DNA的合成。由此推论，3→5外切酶活性的主要功能是校对作用，当加入的核苷酸与模板不互补而游离时则被3→5外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸。;5→3外切酶活性──切除修复作用：5→3外切酶活性就是从5→3方向水解DNA生长链前方的DNA链，主要产生5-脱氧核苷酸。这种酶活性只对DNA上配对部分（双链）磷酸二酯键有切割活力作用，方向是5→3。每次能切除10个核苷酸，而且DNA的聚合作用能刺激5→3外切酶活力达10倍以上。因此，这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起着重要作用。对冈崎片段5末端RNA引物的去除依赖此种外切酶活性。;3、常用DNA聚合酶的用途;缺口;2. Klenow 聚合酶;从栖热水生菌（Thermus aquaticus）分离，最适温度75℃-80℃。 特点：热稳定性 70