第二章 基因工程工具酶2PPT.pptVIP

第一节 限制性内切酶和DNA分子切割;无法归入上述R-M系统的酶;4. 应用限制酶时的注意事项 ;4. 应用限制酶时的注意事项 ;4. 应用限制酶时的注意事项;4. 应用限制酶时的注意事项;第二节 DNA连接酶和DNA分子连接;1.DNA连接酶的种类和催化特性;1.DNA连接酶的种类和催化特性;2.1.2 连接策略;;3.3.2 Linker连接策略;3.3.3 利用double-1inkers技术，实现外源DNA片段的定向克隆;3.3.4 Linker 连接的缺点;3. Join the blunt-ended DNA  molecules;实际困难：处在同一反应体系中的各个DNA接头分子的粘性末端之间会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子。;解决办法：;第三节 DNA聚合酶;1. DNA聚合酶的种类及其特点;2. 大肠杆菌DNA聚合酶I及Klenow片段 ;2.2 DNA聚合酶I催化合成DNA的互补链的条件 （1）全部四种脱氧核苷5’—三磷酸dNTPs (dATP、dGTP、dCTP、dTTP)和Mg2+。 （2）带有3’—OH游离基团的引物链。如此DNA聚合酶I才能将脱氧核苷酸加到这段预先存在的DNA引物链的3’－OH末端。 （3）DNA模板，它可以是单链的，也可以是双链的。双链的DNA只有在其糖—磷酸主链上有一至数个断裂的情况下，才能是有效的模板。;2.3 DNA聚合酶I在基因工程中的用途;nick translation;2.4大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段;在基因工程中的主要用途有： 修补经限制酶消化形成的3’-凹末端,用[32P]dNTP补平3’-凹端，对DNA片段进行末端标记； cDNA克隆中第二链的合成； 在体外诱变中用于从单链模板合成双链； 应用Sanger末端终止法进行基因组DNA测序。 其中，对具有3’-凹末端的DNA片段作放射性标记最有效(用α-32P-dNTP)。 ;Klenow酶标记DNA片段末端的原理;3. T4 噬菌体DNA聚合酶 ;4 .逆转录酶 ;第四节 RNA聚合酶;依赖DNA的RNA聚合酶;第五节 DNA及RNA的修饰酶类 ;2. T4多核苷酸激酶;3. 碱性磷酸酶 ;;第六节 核酸外切酶 ; 核酸外切酶III的主要活性是，按3’→5’的方向催化双链DNA自3’－OH末端释放5’－单核苷酸。 主要用途是：通过其3’→5’外切酶活性使双链DNA分子产生单链区以作为大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的底物(如在链特异性探针时)；另一用途是与S1核酸酶或T4 DNA聚合酶配合作用构建单向缺失（因exoIII只降解3’凹端的DNA而不降解3’端突出的DNA???子）。 ;第七节 单链核酸内切酶;