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2018-05-18 发布于上海
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crisprcas系统介导在哺乳动物细胞中mir505基因敲除word格式论文

CRISPR/Cas系统介导在哺乳动物细胞中mir-505基因的敲除摘要目的：CRISPR/Cas系统是一种新型的基因组编辑技术，Cas9核酸酶能够通过20bp的引导序列而导向特异的基因组位点而使DNA 发生双链断裂。同时microRNA是一类长度约22 nt的非编码小RNA，在各种生物过程中起到调节功能，如细胞的生长，增殖以及凋亡等。本文通过针对mir-505 基因位点，设计两条sgRNA，从而利用CRIPSR/Cas系统对mir-505基因位点进行编辑，探讨CRISPR/Cas 系统对靶点的剪切效率的影响因素。为了更深入地研究mir-505的生物学功能，我们尝试将mir-505基因整体敲除。因此在CRISPR/Cas系统介导下，通过同源重组作用将mir-505 基因整体替换，从而得到mir-505 敲除细胞。随后，我们以mir-505敲除细胞为研究对象，进行各项生物学特性检测。方法：针对mir-505基因设计两条具有不同GC%的sgRNA，随后分别将它们构建入sgRNA表达载体和Cas9蛋白/sgRNA共表达载体。其中Cas9 蛋白/sgRNA共表达载体能够同时表达sgRNA和Cas9 蛋白，从而实现sgRNA和Cas9蛋白的共传递。分别将构建好的表达载体利用脂质体转染法转染入哺乳动物细胞中，通过T7E1assay和DNA测序的方法检测其剪切效率。结果证明实验所设计的CRISPR/Cas系统的确能够在mir-505靶点起作用，并且揭示不同的ICRISPR/Cas 系统对靶点剪切效率有所差异。为了整体敲除mir-505基因，我们将打靶载体和CRISPR/Cas系统载体一同转染细胞，通过同源重组修复将mir-505整个基因进行整体替换敲除，再利用G418 抗性筛选的方法得到mir-505敲除细胞。利用Real-TimePCR对mir-505基因拷贝数检测以及MTT法测定细胞生长速度的方法比较mir-505 敲除细胞和野生型细胞间的差异。结果：成功构建靶向mir-505基因位点的CRISPR/Cas系统载体，能够正确靶向mir-505 位点，并在靶点处发生双链剪切。结果显示CRISPR/Cas系统对靶点的剪切效率与Cas9蛋白和sgRNA的剂量成正比；当sgRNA与Cas9蛋白共传递时，也能够明显提高靶点的剪切效率；此外，对靶向mir-505基因的两个不同位点的sgRNA而言，较高GC%的sgRNA有较高的剪切效率。将CRISPR/Cas系统载体和打靶载体共转染哺乳动物细胞，经G418抗性筛选后得到的mir-505 敲除细胞。经Real-Time PCR 对mir-505 基因拷贝数检测发现CRISPR/Cas系统所介导的同源重组更可能够得到mir-505单等位基因敲除细胞，而不是双等位基因敲除。经细胞生长速度测定，发现和野生型细胞相比，敲除细胞的生长速度明显减慢，且两者差异日渐增大。为了获得mir-505完全敲除的细胞，我们尝试在mir-505单等位基因敲除细胞的基础上再一次利用同源重组进行敲除，得到mir-505 双等位基因敲除细胞。结论：本研究利用CRISPR/Cas系统靶向哺乳动物细胞的mir-505基因，使得mir-505基因发生突变。CRISPR/Cas系统对靶点的剪切II效率和sgRNA和Cas9蛋白的剂量、sgRNA是否和Cas9蛋白共传递以及sgRNA的GC%有关。而mir-505敲除细胞的生长速度明显减慢，说明mir-505在调控细胞的生长，增殖过程中起到一定的调控作用。关键词：CRISPR/Cas系统，mir-505，哺乳动物细胞，基因敲除，同源重组IIICRISPR/CAS SYSTEMINDUCEDMIR-505KNOCKOUTIN MAMMALIANCELLSABSTRACTObjective：CRISPR/Cassystemis anovelgenome-editing tool,the Cas9 nucleaseis guided to thespecificgenomiclocibya20ntguidesequenceandmakesDNAdoublestrand break.MicroRNAsareakindofnon-codingsmallRNAsinalengthof22nt,andfunctionasregulatorsinavarietyofbioprocesses,suchascellsgrowth,proliferationandapoptosis.Inthis work,wedesignedtwosgRNAstargetedtomir-505locustoinducemir-505genomicloci modifiedbyCRISPR/Cassystems.Andinves