cpgodn减轻辐射损伤作用的效应及其机理分析word格式论文.docxVIP

胞，通过CASY 细胞计数及分析系统记录细胞数量；（3）骨髓HE染色：小鼠6Gy照后给予不同处理，在照后1d，9d，28d 取小鼠股骨，经过固定、脱钙，最终制作成HE染色切片；（4）外源性脾集落形成单位测定：参照Till和McCulloch 在1961 年报道的经典方法[16]；3.CpG-ODN2395 对小肠组织辐射损伤的治疗效应（1）小肠HE染色：小鼠6Gy照射后给予不同处理，在照后5d 取小肠，将样本用福尔马林固定，最终制成HE切片；（2）小肠内TUNEL隐窝细胞原位凋亡：小鼠6Gy照射后给予不同处理，在照后5h 取小肠，将样本用中性福尔马林固定，最终制成TUNEL切片；（3）小肠内BrdU隐窝细胞增殖：小鼠6Gy照射后给予不同处理，在照后3d 取小肠，取小肠前2h 腹腔注射BrdU（2.5mg/只），将样本用中性福尔马林固定，最终制成BrdU免疫组化切片；（4）微核细胞率：HIEC 照后给予不同处理后加入细胞松弛素B（CB），孵育36h 后，细胞固定，DAPI染色，计数微核细胞率（micronucleus cell frequency，MNCF）；4.CpG-ODN2395 减轻辐射损伤的作用机理（1）细胞中NF-κB活化：Western 法检测细胞中NF-κB抑制因子IκB-α和NF-κB亚基p65 的变化，并通过GeneTools 软件对蛋白进行定量分析。（2）血液中氧化应激指标：小鼠6Gy照射后给予不同处理，在照射后2d，4d，7d取小鼠血浆，检测血浆中的MDA，GSH 和SOD的变化；（3）小肠内SOD免疫组化切片：小鼠6Gy照射后给予不同处理，在照后5h 取小肠，用中性福尔马林固定，最终制成SOD免疫组化切片；（4）细胞因子含量：小鼠给予CpG-ODN2395 后0.5、1、2、4、8、24、48h 取小鼠血浆，通过ELASA检测血浆中G-CSF，TNF-α和IL-6 的变化。5采用SPSS13.0 对实验相关数据进行统计分析。实验结果1.CpG-ODN2395 的设计与制备，并初步评价其对细胞和小鼠的毒性（1）本次课题选用的CpG-ODN类型为CpG-ODN2395，共有22 个核苷酸序列组成。其序列为：5?-TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3?。并对部分碱基进行硫代修饰（黑体加下划线的碱基为硫代修饰，其他碱基为磷酸化修饰）。（2）细胞毒性试验：在HIEC 细胞培养液中加入不同浓度的CpG-ODN2395 (0μM~5.00μM)，通过MTT法检测发现低浓度的CpG-ODN2395对细胞的存活率没有影响，当浓度高达2.5μM 时细胞存活率才出现降低，而试验中所用的CpG-ODN2395浓度为0.1μM，远远低于产生细胞毒性的剂量，所以可以认为CpG-ODN2395 对细胞是安全的或很少有毒副作用；（3）动物急性毒性试验[17]：小鼠分别给予高剂量CpG-ODN2395(450、900、1350μg/只)，观察14d未发现小鼠体重减轻和死亡，而试验中给予小鼠的CpG-ODN剂量仅为50μg/只，远远低于急性毒性试验中的剂量，所以可以认为CpG-ODN2395 是没有或很少有急性毒性作用。2.CpG-ODN2395 对小鼠骨髓造血系统辐射损伤的治疗作用（1）不同剂量照射后小鼠存活率：小鼠分别给予6.0Gy，6.5Gy，8.0Gy和10Gy 照射后，单纯照射组存活率分别为95%，58%，35%和0%；照射给药组在存活率为100%，89%，81%和25%。进行剂量-存活率直线拟合计算出单纯照射组LD50/30为7.6Gy，照射给药组LD50/30为9.0Gy，DRF值为1.2；（2）外周血白细胞和骨髓有核细胞计数：6.0Gy照射后1d（初期），9d（极期），28d（恢复期）检测外周血白细胞和骨髓中有核细胞数，发现照射给药组外周血白细胞和骨髓有核细胞数在照后1d，9d 和28d 都比单纯照射组高，特别是在照后9d 和28d 统计时尤为显著；（3）骨髓HE染色切片：6.0Gy照射后，照射给药组与单纯照射组比较，其骨髓损伤较轻，造血功能恢复较快；切片结果与骨髓有核细胞计数结果相吻合；（4）外源性脾集落形成单位测定：通过脾结节数量反映骨髓内多能造血干细胞的含量，实验结果表明照射给药组骨髓细胞在受体小鼠体内形成的脾结节数是单纯照射组的2.1 倍；3. CpG-ODN2395 对小鼠小肠组织辐射损伤的治疗作用（1）小肠HE染色：6.0Gy照射后5d，HE 染色观察小肠照后病理学变化，发现照射给药组小肠组织形态比单纯照射组完整；（2）小肠TUNEL隐窝细胞原位凋亡：6.0Gy照射后5h，对TUNEL原位凋亡染色观察和定量发现，照射给药组小肠的隐窝细胞和上皮细胞阳性率比单纯照射组要低；（3）小肠BrdU细胞增殖检测