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BTG2 相互作用 CCR4-NOT 蛋白质复合体的新功能研究摘要人类细胞中 BTG/Tob 蛋白家族的六个成员（BTG1，BTG2PC3/Tis21，BTG3/ANA， BTG4/PC3B，Tob1/Tob 和 Tob2)，在细胞周期调控、细胞生长与分化、DNA 损伤修复 等方面发挥着重要功能[1-5]。在多种肿瘤如肝癌、乳腺癌、肾癌中，BTG/Tob 蛋白表达 均降低或缺失，基因敲除小鼠肿瘤发生率明显高于对照组小鼠，表明 BTG/Tob 蛋白表 达下调是肿瘤发生发展过程中的重要分子事件，其作为新的抑癌基因的功能正逐步得 到证实。必威体育精装版研究表明，BTG/Tob 还参与细胞核内转录及胞浆 mRNA 脱腺苷酸化的调 控，而与 CCR4-NOT 蛋白复合体的相互作用是 BTG/Tob 发挥这一功能的前提条件[6-8]。进化高度保守的 CCR4-NOT 蛋白复合体具有 3-5核酸外切酶活性，在人类中包含 9 个亚基：CNOT1，CNOT2，CNOT3，CNOT6/hCcr4a，CNOT6L/hCcr4b，CNOT7/hCaf1， CNOT8/hPop2，CNOT9 和 CNOT10。其中，CNOT6，CNOT6L，CNOT7，CNOT8 是细胞中主要的腺苷酸酶，通过脱腺苷酸化作用降解 mRNA 及特定转录产物[10-12]，从而 在真核生物的基因表达调控中发挥重要作用。研究发现除 BTG4 外，所有 BTG/Tob 家族蛋白均可与高度同源的 CNOT7 和/或 CNOT8 相互结合[13-17]。晶体结构研究揭示，由 5 个 α 螺旋结构、4 个 β 折叠构成的 BTG/Tob 区域是 BTG/Tob 蛋白与 CNOT7 结合的特征性区域[18-20]，而 BTG2 及 Tob1 BoxA 和 BoxB 区域的关键亚基也与 CNOT7 有相互作用[21]，此外，最近还报道 Tob1 的 C 端区域也可与 CNOT1 亚基结合[22]。因此，BTG2 及 Tob1 可通过相互结合作用招 募 CCR4-NOT 复合体促进特定 mRNA 的脱腺苷酸化以发挥调控转录的功能。更重要 的是，BTG/Tob 与 CNOT7 结合复合体结构的形成对 BTG/Tob 蛋白有效发挥其抗增殖 特性同样是必不可少的。这些研究高度提示 BTG/Tob 蛋白与 CCR4-NOT 蛋白复合体 关系密切，二者相互结合，相互调控，共同参与多种细胞生物学行为的调节。前期研究发现，CCR4-NOT 蛋白复合体在 DNA 损伤修复、组蛋白甲基化、精子 发生等方面均发挥着重要作用，表明除参与 mRNA 降解之外，CCR4-NOT 蛋白复合体 各亚基还具有更重要的生物学功能。本研究在前期工作基础上，对 CCR4-NOT 蛋白复 合体在神经系统中的新功能进行初步探索和揭示，旨在补充和完善其功能研究，为进 一步阐明 CCR4-NOT 蛋白复合体的生物学意义提供实验依据。研究目的1. 广泛研究 CCR4-NOT 蛋白复合体在小鼠脑组织及神经细胞中的表达模式，初 步揭示其在神经系统中的新功能；2. 探讨 CCR4-NOT 蛋白复合体抑制神经母细胞瘤细胞 Neuro-2a 分化的作用及可 能分子机制。研究内容和方法1. BTG2 及 CCR4-NOT 蛋白复合体在正常小鼠中的组织表达模式：利用 Northern Blot 和 Western Blot 方法广泛研究 BTG2 和 CCR4-NOT 蛋白复合体各亚基在正常小鼠 中的组织表达情况，为进一步揭示其功能提供实验基础；2. CCR4-NOT 蛋白复合体在小鼠脑组织及神经细胞中的表达模式：利用 Western Blot 和 β-Gal Staining 方法研究 CCR4-NOT 蛋白复合体各亚基在正常小鼠脑组织中的 具体表达情况；培养神经干细胞，少突胶质细胞祖细胞等重要的神经细胞，通过维甲 酸、去细胞因子等方法有效诱导其定向分化，利用 Western Blot、Immunostaining、siRNA 干扰等研究 CCR4-NOT 蛋白复合体各亚基在小鼠神经细胞中的表达模式及可能发挥 的功能。3. CCR4-NOT 蛋白复合体在神经母细胞瘤细胞 Neuro-2a 中的抑制分化作用：利用 Neuro-2a 作为神经样细胞分化模型，通过构建 siRNA 腺病毒载体和表达载体，研究在 抑制和过表达 CCR4-NOT 亚基后对 Neuro-2a 分化的作用及可能分子机制。研究结果1. BTG2 及 CCR4-NOT 蛋白复合体在正常小鼠中的组织表达模式：BTG2 基因在正常大鼠肾脏中有较高丰度表达，在肺脏、肝脏、大脑、心脏呈低 丰度表达，肌肉、胸腺、脾脏中无表达；CCR4-NOT 复合体在小鼠各组织中呈广泛表 达，尤其在大脑、肺脏、小肠、