遗传学实验课（南京大学）实验五 CCK-8法检测细.pptVIP

实验五 CCK-8法检测细胞活力实验 实验原理 Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。 用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验 试剂 CCK-8试剂盒 30% 双氧水 96-well 板 酶标仪 细胞毒性测定步骤 1、制备细胞悬液：细胞消化并计数。 细胞毒性测定步骤 2、接种到96孔板中：合适的细胞数铺板（L16细胞：约2×104/well），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做6个重复。 细胞毒性测定步骤 3、37℃培养箱中培养：细胞接种后，培养24小时。 细胞毒性测定步骤 4、稀释H2O2，按照5×，10× ，20×的倍比浓度稀释H2O2。且于96孔板中，分别不加，或加入10μl 体积的5×，10 × ，20×的 H2O2，处理10min。 记住：H2O2的稀释一定要准确，否则会影响下面的结果 不种细胞，H2O2 0× H2O2 0× H2O2 20× H2O2 10× H2O2 5× 细胞毒性测定步骤 记住：从高稀释倍数到低稀释倍数加入H2O2 细胞毒性测定步骤 5、H2O2处理10min后，从培养板中吸走培养液，再在原孔中加入100μl新鲜培养液。 注意：一个孔一个孔地吸，洗得彻底，吸完后将板轻轻在吸水纸上反扣，目的是为了去除原液和气泡；加新鲜培养液时不要产生气泡。 细胞毒性测定步骤 6、加入5ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。 细胞毒性测定步骤 7、再在培养箱中培养1.5～2小时进行显色:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。 细胞毒性测定步骤 8、用酶标仪测定450nm吸光度，excel导出数据。 细胞毒性测定步骤 9、适当舍弃不合适的值，算出每种处理的平均值与标准差，并用平均值减去本底的值，同时与对照进行比较，算出不同浓度H2O2的相对抑制百分率。用excel作柱形图，比较三种浓度H2O2对细胞毒性程度。