3章 细胞研究方法教材课程.ppt

第三章: 细胞生物学研究方法;从整个生命科学的发展趋势看细胞 生物学方法;第一节 细胞形态结构的观察方法;1、分辨率可达0.2μm的光学显微镜 2、分辨率可达2nm的电子显微镜 3、提示蛋白质精确结构的X线衍射 4、测定大分子结构的核磁共振;一、光学显微镜技术（light microscopy） ?1、普通光学显微镜 构成：普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像;显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨率有关. 分辨率(Resolution)：是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为： D=0.61λ/N.A N.A= nsinα/2 公式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。;显微镜的分辨率能否无限提高？如何提高光学显微镜的分辨能力？分辨率表示的是能够区别两个点间最近距离的能力，所以数值越小，分辨率越高。从分辨率的表达式来看，NA越大，分辨率越高，或者波长越短，分辨率越高。; 普通光线的波长为400-700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000倍 ?人眼的分辨率：100 ?m 典型的动物细胞：10～20 ?m 一般的细菌和线粒体：0.5 ?m ?? ;普 通 双 筒 显 微 镜;标 本 制 备;第二步.脱水 第三步.包埋（embed） 目的：包埋使组织变得坚硬,便于切片。 试剂：蜡、树脂 机理：可进入细胞内，起支持作用。 第四步.切片（section） 目的：切成薄片，便于切片黏附在载玻片上进行染色。 仪器：切片机 切片厚度：1～10 ?m ;第五步.染色（staining） 目的：使细胞成为可见. 方法： A.选择性染色 苏木精－细胞内核酸的分布 伊红－细???质染色 ;B.特异性染色 酶 + 底物 抗原 + 抗体;2、荧光显微镜(Fluorescence microscope) 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。 特点： 1、光源为短波光； 2、有两个特殊的滤光片； 3、照明方式通常为落射式;用于观察能激发出荧光的结构。用途：免疫荧光观察、基因定位、疾病诊断。;落射式照明原理 ;荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） ; 荧光的观察 1、自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素。 2、二次荧光 ??非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生 荧光（二次荧光），以便于进行观察 。 3、抗体荧光技术 ??带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合， 这样就能通过抗体结合的荧光观察到抗原。 4、绿色荧光蛋白 ;采用生物学、化学和物理学结合的方法，发明了一种荧光促进剂，激发诸如叶绿素等植物内部潜在的发光物质，让花朵自然产生荧光。;3、激光共聚焦扫描显微境(Laser confocal scanning microscope) 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描； 能显示细胞样品的立体结构； 分辨力是普通光学显微镜的3倍； 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。 ;应用： 观察细胞形态； 细胞内生化成分的定量分析； 光密度统计以及细胞形态的测量。 排除平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构 。 ;激光共聚焦扫描显微镜 ;蓝色为细胞核，绿色为微管 ;4、相差显微镜??(Phase-contrast microscope)PCM 由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。 相差显微镜的基本原理：把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。使肉眼得以观察到无色透明物体中的细节。 ; 细胞内的各结构可因密度不同而产生相位差(即光程差)，不过人眼无法鉴别这种微小的变化。相差显微镜能够把这种“相位差”变成“振幅差”，即图像的明暗差。 特点: 可用以观察活细胞 ;通过致密部分(如细胞核),速度慢通过疏松部位(