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第五章：基因操作中大分子的分离和分析 王林玲 wanglinling2005@163.com 核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段； 优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收： 核酸凝胶电泳的基本原理 1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。 影响DNA在凝胶中迁移速率的因素： 1 DNA分子的大小 2 构象 一般同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状 3 凝胶浓度 4 电压 5 缓冲液 凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶电泳用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA 用于核苷酸多态性的分析 实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带 2. 凝胶载样缓冲液 6×凝胶载样缓冲液配方 琼脂糖凝胶中DNA的染色 使用EB染色注意事项 （1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 2 凝胶SYBR Gold的染色 SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE 在TEMED 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N`-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。 （三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresis PFGE 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。PFGE 解决了这一问题。 （一） PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。 （二）PEGE类型 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field) （三） 影响分辨率的因素 1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。 RNA 电 泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解； 另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。