[农学]第七章 原生质体培养和体细胞杂交.pptVIP

第七章 原生质体培养与 体细胞杂交 本章教学目的与要求 (1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方法。 原生质体（Protoplast） 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 现代生物技术领域中的地位 原生质体研究历史与现状 在20世纪初，原生质体研究领域的先驱者,曾经用机械法制备原生质体 1960年Cocking用酶解法制备番茄根原生质体首次获得成功 1983，1987和1991年举行的第六，七，八届国际原生质体会议，确定了原生质体在基因操作应用中的地位 原生质体研究历史与现状 80年代中期，约有100种植物获得成功 80年代末，成功再生植株的种类增加到212种 至今原生质体培养可形成胚状体并再生植株或芽的种类已经达到367种，分布于46科，160属，其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科、蔷薇科 第一节、原生质体分离及纯化 一、原生质体分离 多数植物分离原生质体的经典材料-----叶肉细胞。 1、机械分离法（Mechanical isolation） （2）分离原生质体 原生质体一步酶解和沉淀纯化游离流程 二、原生质体纯化与活力测定 1、离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。 2、漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：离心。 第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。 1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。 原生质体的活力鉴定结果 第二节 原生质体培养 一、培养基 二、培养方法 原生质体再生体系流程图 番茄+马铃薯 二、融合方法 (一)无机盐诱导融合: NaNO3法 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。 （二）高pH-高Ca离子法 （三）PEG法 （四）PEG结合高钙-高pH诱导法 最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体----滴加PEG溶液，摇匀，静置---滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置---滴加原生质体培养液洗涤数次---离心获得原生质体细胞团---筛选---再生杂合细胞 异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色 本章小结： (1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。 本章小结： （6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐诱导融合；聚乙二醇与高pH高钙相结合的诱导融合；电融合技术。 （8）杂种细胞的筛选与鉴定：互补选择；机械分离杂种 细胞法；双荧光标记选择法 （9）杂种植株的鉴定：形态学鉴定；细胞学观察；DNA内切图谱分析；同工酶分析 四、体细胞杂种植株的鉴定 形态学鉴定 细胞学观察 DNA内切图谱分析 同工酶分析 4-1、形态学鉴定 4-2、细胞学观察 染色体形态和数目的比较 18条染色体 36条染色体 4-3、 DNA内切图谱分析 RAPD带型 （随机扩增的多态性DNA） 三、原生质体再生过程与遗传变异 原生质体再生过程 指分离、纯化的原生质体在适当的培养方法和培养条件下，恢复细胞壁，再生细胞持续分裂形成细胞团，最后通过愈伤组织或胚状体分化出完整植株的过程。 （一）原生质体再生过程 1、细胞壁再生 ◆有活力的原生质体具有再生和分裂的潜在能力 ◆细胞壁的再生是细胞分裂的先决条件 ◆原生质体培养数小时后开始再生细胞壁，两天至数天细胞壁再生完成 2、细胞分裂 ◆再生细胞不一定进行有丝分裂 ◆原生质体植板率变化很大 ◆不正常的有丝分裂 第一