Wnt10b在肝癌细胞HepG2、Huh7及Bel7402中的表达及意义.docVIP

精品论文 参考文献 Wnt10b在肝癌细胞HepG2、Huh7及Bel7402中的表达及意义 范晓丽 孙莉 　　(广西桂林医学院 541004) 　　【摘要】目的：探究Wnt10b在肝癌细胞HepG2、Huh7及Bel7402中的表达。方法：Trizol法提取RNA，Real-time PCR检测Wnt10b在肝癌细胞中的表达。结果：HepG2细胞中Wnt10b的表达量最高，huh7最低。结论：从RNA水平上分析，Wnt10b在HepG2细胞中的表达高于Huh7及Bel7402。 　　【关键词】Wnt10b 肝癌 Real-time PCR 　　【中图分类号】R730 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2014）15-0252-02 　　Wnt信号通路分为经典Wnt通路(Wnt/beta;-catenin信号通路)和非经典Wnt通路[1]。研究表明，Wnt10b编码的分泌型蛋白能够激活高度保守的经典Wnt/beta;-catenin信号通路。肝细胞癌中存在Wnt1、Wnt2和Wnt10b蛋白的高表达，这些Wnt蛋白的异常表达是Wnt信号通路异常活化的重要起始条件[2]。为了进一步探究Wnt10b在肝癌中的作用，我们通过Real-time PCR的方法测定肝癌细胞HepG2、Huh7及Bel7402中Wnt10b的表达，筛选Wnt10b高表达的细胞株，为进一步实验打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1材料与试剂 　　肝癌细胞系HepG2、Huh7及Bel7402由上海细胞所购买。DMEM 培养液、胎牛血清购于 Gibco公司。Trizol、PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser购自Takara，SuperReal PreMix (SYBR Green)购自TIANGEN。 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养 　　在 5％二氧化碳、37℃条件下， 细胞置于含10％胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100mg/L 链霉素的DMEM培养液中培养。待细胞融合至80％，用0.25％胰酶消化传代后接种(细胞密度5times;104) 于培养瓶，待细胞融合至约 70％后用于实验。 　　1.2.2 RNA提取及反转录 　　应用Trizol提取RNA，按说明书要求操作。以紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和浓度。根据反转录试剂盒的说明书的步骤将RNA反转录为cDNA。 　　1.2.3荧光定量PCR检测 采用SYBER Green荧光法，使用ABI7500Fast荧光定量PCR仪进行PCR扩增及结果分析。取反转录后的cDNA 2ul作为模板，按照TAKARA试剂盒的说明，配制反应体系进行扩增。 　　1.3数据处理 　　采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，数值以均数plusmn;标准差表示。检验水准alpha;=0.05。 　　2 结果 　　2.1实时荧光定量PCR检测 　　提取的总RNA经紫外分光光度计检测D 280/D260在1.8～2.0，经琼脂糖凝胶电泳试验鉴定，可见明显的28S，18S两条区带，纯度和质量较高，可用于荧光定量PCR检测。证明所提取的RNA质量较好。荧光定量PCR结果可见各样本的扩增曲线都已达平台期，溶解曲线单峰，特异性好。 　　图1 Real-time PCR结果 　　2.2 Wnt10b在细胞中的表达 　　通过比较荧光定量PCR的结果发现HepG2细胞中Wnt10b的表达量最高，huh7最低。(见图1)。 　　3 讨论 　　Wnt信号通路作为一种在进化中高度保守的信号通路,在生长、发育、代谢和干细胞维持等多种生物学过程中发挥重要作用。Wnt通路的失控与癌症、肥胖和糖尿病等疾病的发生有密切联系。Wnt信号通路广泛存在于多细胞真核生物中，主要由细胞外因子Wnt，跨膜受体蛋白(Frizzled)、beta;-连环蛋白等等组成。 　　目前，对于Wnt/beta;-catenin信号途径作为细胞信号转导系统之一在肿瘤发生中的功能研究较为深入，涉及信号转导、细胞增殖、凋亡及细胞周期等方面。已经有研究证实在人类的乳腺癌、前列腺癌、原发性肝癌、结直肠癌、胃癌、骨肉瘤等十几种已知的高发性癌变中存在Wnt信号通路的异常激活[3-7]。 　　Wend P等[8]研究发现Wnt10b可以通过活化Wnt/beta;-catenin通路引起HMGA2的表达促进高侵袭性乳腺癌细胞的增殖，表明Wnt10B在乳腺癌的发生发展中起重要作用。HirohideYoshik等发现在原发性肝癌和结肠癌中异常Wnt10B DNA的