RNA干扰Twist基因表达抑制HCC9402侵袭转移的实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 RNA干扰Twist基因表达抑制HCC9402侵袭转移的实验研究 钱明1 朱东明2（1.江苏省苏州市横泾医院 215009;2.苏州大学附属第一医院 215006） 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085 (2010)35-0084-03 【摘要】 目的 探讨RNA干扰Twist基因表达对肝细胞癌细胞（HCC9402）转移的抑制作用。方法　用脂质体转染法将表达siRNA-Twist的真核表达载体pGenesil-1-Twist-siRNA (pTwist-siRNA)和空载体pGenesil-1-Neg-siRNA (pNeg-siRNA)导入HCC9402 细胞，G418筛选阳性细胞，获得稳定转染的阳性克隆。观察siRNA-Twist对Twist表达的沉默及对肝细胞癌细胞体外侵袭转移的抑制作用，采用RT-PCR技术检测不同处理组细胞中Twist mRNA 的表达水平，Western-blot测定蛋白表达水平。建立不同组裸鼠原位肝细胞肝癌模型，观察Twist沉默对裸鼠原位肝细胞肝癌转移的抑制作用。结果　pTwist-siRNA组细胞内Twist mRNA及Twist蛋白的表达被有效沉默。重组细胞基底膜(Matrigel)侵袭实验显示, pTwist-siRNA组、空白对照组、pNeg-siRNA组穿透基底膜细胞数分别为( 35plusmn;10) 、( 219plusmn;72)、( 228plusmn;71)个/高倍镜(times;200) ，前组明显低于后两组，差异分别有统计学意义( Plt;0.05)。裸鼠体内实验表明，pTwist-siRNA组的肿瘤转移结节、肝脏转移结节、腹水明显减少。结论　RNA干扰Twist基因表达对肝细胞肝癌细胞侵袭转移有抑制作用, Twist可能成为肝细胞肝癌基因治疗的新靶点。 【关键词】 肝细胞肝癌 Twist 小干扰 肿瘤转移 多个研究报道，Twist基因在多种恶性肿瘤中存在明显上调，Twist上调的肿瘤容易出现远处转移、较深的肿瘤浸润深度和较差的预后【1-7】。Hotz等【8】新近发现，肝细胞肝癌组织及高转移潜能的肝细胞肝癌细胞株存在Twist的明显上调。我们推测，干扰Twist能抗肝细胞肝癌转移作用。 基于上述理论，本课题旨在研究Twist干扰对肝细胞肝癌侵袭、转移的影响，为抗肝细胞肝癌转移提供新的基因靶点。 材料和方法 1 材料 1.1试剂 RPMI1640购于Hyclon公司，小牛血清购于杭州四季青公司，胰酶为国产。质粒提取试剂盒购于AXYGEN,连接试剂盒RNA提取试剂、cDNA合成及PCR扩增试剂, G3PDH购于TaKaRa； Lipofectamine购于INVITROGEN，质粒提取试剂盒购于AXYGEN, Millicell（小室）由MilliPore公司生产，Matrigel和6孔板购于美国BD公司。Twist-shRNA-1和shRNA-1质粒由海口市人民医院 王齐全教授惠送，兔抗人多克隆抗体Twist购于SANTA CRAUZ公司。 1.2 细胞株和裸鼠 HCC9402肝细胞肝癌 细胞株购于中国科学院上海生物研究所细胞库，细胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培养基培养，细胞培养条件为37℃恒温，饱和湿度和5%CO2，指数生长的细胞为实验对象。 取4周龄健康纯种BALB/c-nu/nu雌性裸鼠，体重18～22g，在海南医学院动物实验中心SPF级饲养，称重，编号。实验对象共分为三组：pTwist-siRNA组、空白对照组、pNeg-siRNA组。 2 方法 2.1 基因转染及稳定表达细胞株的筛选 HCC9402细胞在含有10%小牛血清的DMEM培养基中,37℃、5 %CO2条件下培养。用0.25 %的胰酶消化细胞后,按每孔4times;104个细胞均匀加入96孔板中,培养至细胞85%～90 %汇合后,分别转染pTwist-siRNA和pNeg-siRNA质粒,具体操作按照脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 说明书进行。转染24 h 后将细胞以1∶10 比例传代,次日开始用含有500mu;g/ mL G418 的培养基进行筛选培养,每3d更换一次培养基,连续筛选3 周,然后将获得的细胞克隆,扩大培养。 2.2 RT-PCR测定Twist-shRNA-1作用HCC9402细胞后Twist mRNA表达 按TRizol试剂盒( Invitrogen公司)说明书操作提取稳定转染pTwist-siRNA，pN