HBV抗原肽-HLA-A0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞.docVIP

精品论文 参考文献 HBV抗原肽-HLA-A0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞 刘先进1 吴月平1 张红春2 韩刚1 沈张平2 宋健辉2 季沈杰2 陈琳1 （1南通市第三人民医院 226006；2启东市人民医院 江苏南通 226006） 【摘要】目的 研究不同临床感染状态慢性HBV患者外周血HBV特异性CD8+T淋巴细胞（CTL）频率的变化及临床价值。方法 采用HBcAg18-27表位肽-HLA-A*0201五聚体（MHC Pentamers）及CD8单克隆抗体，设计流式细胞技术检测外周血中针对该肽段的特异性CTL数量，以占总计数CD8+细胞数的百分比表示，同时对HLA-A2等位型进行鉴定。结果 18例非HBV感染患者中12例HLA-A2-（对照组）特异性CTL数为0.33％-3.90％，中位数为1.04％。HLA-A2-的CHB、LC、HLA-A2+的CHB特异性CTL数为分别为0.25％-10.69％、中位数1.60％、n=24，0.34％-12.20％、中位数1.85％、n＝13，0.20％-29.90％、中位数1.41％、n＝24，三者与对照组无显著差异。HLA-A2-的PHC、HLA-A2+的LC、PHC特异性CTL数分别为1.27％-20.30％、中位数6.69％、n=5，0.14％-18.40％、中位数2.88％、n=18，0.72％-39.22％、中位数1.33％、n=7，三者显著高于对照组。HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数显著高于相应未抗病毒治疗者。HLA-A2+未抗病毒组中血清HBVDNAlt;103copies/mL、ALTlt;40IU/L者特异性CTL频率有增高趋势。结论HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术能在体外直接检测外周血HBV特异性CTL频率的变化，其水平一定程度反映不同临床感染状态慢性HBV感染患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的差异。 【关键词】 HLA-A2抗原 MHC-五聚体 CD8+T淋巴细胞 流式细胞术 【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）24-0032-03 乙型肝炎病毒(HBV)病毒本身及其在体内的复制并不引起肝细胞的损伤,它的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变,而特异性细胞（T辅助细胞、细胞毒性T细胞）免疫机制可能是乙型肝炎发病机制的中心环节；CTL活化以及生物学效应都严格受HLA-I限制，不同HLA-I等位型个体可以有不同的抗原表位，研究抗原特异性CTL必须结合具体HLA-I等位型。我们采用的表位肽是针对HLA-A*0201等位型个体（与HLA-A2相同），在四聚体基础上改进的五聚体 (MHC pentamers ) 法结合流式细胞技术定量分析不同临床感染状态慢性HBV患者外周血抗原特异性CTL， 探讨其临床应用价值。 1 材料和方法 1.1 研究对象 91例慢性HBV感染患者中48例慢性乙肝（CHB）、31例肝硬化（LC）、12例原发性肝癌（PHC），诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒以及CMV、EB病毒、HIV感染，无自身免疫性疾病，无嗜酒史，无肝毒性药物使用史，其中51例进行核苷类药物抗病毒治疗。以18例手足口病、妊娠肝损害、酒精性肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等非HBV感染者作对照。 1.2 主要试剂及来源 FITC结合鼠抗人HLA-A2单克隆抗体购自Serotec公司。FITC结合的鼠抗人CD8单克隆抗体、溶血素购自BD Pharmingen公司，HLA-A*0201限制 HBV抗原表位肽-五聚体复合体（Pro5TM MHC Prenamers）购自英国Proimmune公司，所含HBV抗原表位肽为HBcAg 18-27，序列为FLPSDFFPSV。HBV血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HbcAb检测试剂购自美国Abbott公司，血清HBVDNA含量检测采用上海科华试剂，检测限103copies/ml。 1.3 HLA-A2等位型的鉴定 采用流式细胞术, 所有研究对象取100ul肝素钠抗凝新鲜全血,加入检测管和对照管,分别加入HLA-A2单克隆抗体及同型对照10 ul,16-27℃，避光放置30 min,经溶血、FACS洗涤液洗涤,FACS固定液固定,4℃保存,用于流式细胞仪检测，同时每份标本均设阴性对照。 1.4