人体瘢痕疙瘩前体细胞的分离培养及向脂肪细胞的定向诱导分化.pdfVIP

2013年 1O月第 19卷第 5期 ChinJMedAesth Cosmet，October2013，Vo1．19，No．5 为组织工程脂肪 的种子细胞来源提供理论和实验依 标记抗体 ：FITC—mous(~antihumanCD29、CD34； 据 。 PE—mouse antihuman CD44、CD105；Phycoery— thrin—Cy5一mOLlSe antihuman—CD45、CD109 (以 材料与方法 1：1001 FBS的PBS稀释)，冰上孵 育 30rain。 一 、 材料 用 1 多聚 甲醛清洗 、固定 。悬浮在含 1 FBS的 1．实验取材 ：本实验瘢痕疙瘩标本来 自中山大 PBS中行流式细胞仪分析。需确定无特异信号，对 学附属第一医院行手术治疗的4例 28～35岁的瘢 照细胞培养与同型匹配的免疫球蛋 白和相 同标记二 痕疙瘩患者 (均获知情许可权)。所选均为皮肤创伤 抗一起孵育 。Winmdi2．9软件分析、绘制图形。 后形成超出原有损 害范 围的异常瘢痕，并且均行病 5．成脂诱导分化 ：取长势 良好 的第 2代 KPC 理学检查确诊为瘢痕疙瘩。 及 SKP按 2×10 细胞 ／L密度接种于 6孔板。 2．主要仪器与试剂 ：L—DMEM、H—DMEM 培 细胞完全融合后 ，加入含 1t~mol／L 的地塞米松 ， 养基 ，胎 牛血清 (FBS)、胰蛋 白酶 ；人碱性成纤维细 0．5mmol／L的3一IBMX，10mg／L的牛 胰 岛 素 ， 胞生长 因子 (bFGF)；青霉素 ，链霉素 ，两性霉素 ；地 100mmol／L的消炎痛 ，10 FBS的H—DMEM 诱 塞米松 ，3一异丁基一1一甲基黄 嘌呤 (3-IBMX)；超净工 导 3d；再用含 10mg／L的牛胰岛素 ，1O％FBS的 作台；自控式 CO 恒温培养箱 ；倒置相差显微镜 。 H—DMEM 处理 1d。如此循环 3次后 ，用含 10mg／L 二 、方法 的牛胰岛素、10 FBS的H—DMEM 处理 7d，每隔 1．KPC 的体 外培养 ：取瘢 痕疙瘩组织在无菌 3d换液 1次 ；空白对照组用含 10mg／L的牛胰岛 条件下，以磷酸盐缓冲液 (PBS，含 1 庆大霉素) 素 ，10 FBSH—DMEM，每 3d换液 1次 。光镜下 冲洗 2次后 ，将组织剪成 5～6mm。小片 ，泡入含 观察细胞形态和生长情况。诱导后 的细胞用 PBS 3mg／ml中性蛋 白酶 的PBS中，4。C孵育过夜 。剥 洗涤 3次，1O 多聚 甲醛 固定 10rain，油红 O染色 离组织表皮层 ，所余真皮层切成 1mm。小块 ，放入 5～10rain，6O 异丙醇洗去多余染液 ，蒸馏水洗， 含 4mg／ml胶 原酶 工的PBS中，37℃消化 2h， Mayer苏木素浅染核 ，1 盐酸水稍分化 ，水漂洗 70 “m 细胞滤膜过滤 ，重悬浮细胞接种于未处理 的 10rain。倒置相差显微镜下观察 ，随机选 5个视野 ， 75cm。培养瓶 ，加入 改 良L—DMEM (含 2ng／ml 每视野计数 500个细胞 ，计算阳性分化率。 bFGF，10 FBS，100U／ml青霉素 ，100t~g／ml链 结 果 霉素 ，2mmol／L谷胺酰胺 ，100mmol／L非必需氨