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P6BMP2克隆及其在大肠杆菌中表达 　【摘要】 目的：在大肠杆菌中克隆和表达骨形态发生蛋白2（BMP2）的变体P6BMP2并初步纯化。方法：根据P6肽的氨基酸序列，按照大肠杆菌偏爱密码子将P6肽的核酸序列设计在5′端引物，通过PCR方法合成P6BMP2基因，并将其克隆到大肠杆菌表达质粒pALEX中，经NcoⅠ、XhoⅠ双酶切和DNA序列测定验证。结果：通过双酶切和DNA序列分析，证实获得的基因片段与我们期望的相符合，重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导获得表达。表达产物经超声破碎和Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow亲和层析纯化，获得重组蛋白。结论：构建了P6BMP2的表达质粒，获得P6BMP2的表达并建立了纯化方式，为P6BMP2的深入研究和应用奠定了坚实的基础。 【关键词】 骨形态发生蛋白;P6;P6BMP2;大肠杆菌;胶原蛋白;表达 自1965年Urist[1]发现骨基质中含有能够诱导异位成骨的骨形态发生蛋白(bone morphogenefic protein，BMP)以来，研究者们经过大量动物实验和临床应用研究证实，BMP能在非骨组织如肌肉中诱导形成软骨和骨，是一种高效的骨诱导蛋白，其中BMP2被认为是活性最强的唯一能单独诱导骨形成的因子[2]。由于越来越多的实验证实了BMP2在诱导骨形成和骨修复方面的高效性及安全性，人们开始将其应用于骨科临床，并得到了令人满意的疗效[36]。另一方面,在骨缺损的修复重建过程中，成骨细胞产生的Ⅰ型胶原具有特定的引导骨组织修复再生的生物学特性，在促进成骨细胞的粘附、增殖和分化同时，对破骨细胞的吸收也有一定作用。这些功能据推测与其分子结构中含有特定的细胞识别信号有关[7]，Bhatnagar等[89]发现在Ⅰ型胶原α链中含有有效细胞结合位点，为一段15个氨基酸序列的细胞结合肽，其与ABM(无机骨粒)相结合可模拟骨细胞外基质成分，促进骨再生。Bhatnagar[10]以此为基础,发明了一组用来模拟Ⅰ型胶原蛋白细胞连接域的肽段,IleAla是其核心序列，呈现β弯曲构象。P6肽是其中的一种,其序列是GlnGlyIleAlaGlyGln。周炳荣等[11]的研究显示，P6肽能够刺激人骨髓间充质干细胞的增殖；杨旭东等[12]则将P6肽和无机骨粒复合用来治疗骨缺损，结果显示该复合物具有较强的促进骨缺损修复能力。这些都表明P6肽具有一定的促进间充质干细胞增殖，加快骨组织修复和再生的能力。为了将BMP2和胶原蛋白在引导骨组织修复或再生中的功能结合起来,我们构建了P6BMP2融合蛋白，希望这个融合蛋白可以提高骨形成能力。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 1.1.1 菌株 E.coli克隆菌株Top 10和表达菌株BL21(DE3) 均由本实验室保存。 1.1.2 基因和质粒 pALEX和pCIBMP2由本实验室保存。 1.1.3 酶及化学试剂 各类限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、Taq聚合酶等购自Takara公司；RNasin购自Promega公司；引物片断由上海博彩生物公司合成；柱离心胶回收试剂盒购自华舜公司；Heparin SepharoseTM 6 Fast Flow购自Phamarcia公司；其他化学试剂均为国产分析纯。 　　1.2 方法 1.2.1 质粒DNA提取、DNA酶切及连接转化 参见参考文献[13]方法。 1.2.2 pALEX/P6BMP2质粒构建 P6BMP2序列PCR产物经TBEagarose回收特异片段，溶解于TE溶液中，取适量进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切。质粒pALEX进行NcoⅠ、XhoⅠ双酶切，分别对酶切的378bp 左右的P6BMP2片段和pALEX质粒片段进行柱离心式胶回收，T4DNA连接酶连接，转化E.coli Top10菌株，酶切及PCR法筛选阳性克隆，得到质粒pALEX/P6BMP2。测序验证序列正确，测序引物为T7 terminator 公用引物，引物序列如下（划线处为限制性酶切位点，方框处为P6肽编码区）：P6BMP2 PCR上游引物（P6BMP2 forward）为5′CGTTCCCATGGGACAGGGTATCGCTGGTCAGCAAGCCAAACACAAACA GCGG3′；P6BMP2 PCR 下游引物（BMP2 down）为5′CAAGCCTCGAGTTAGCGACACCCACAACCCTC3′。 1.2.3 质粒DNA序列的测定 由上海博彩生物公司完成。 1.2.4 pALEX/P6BMP2质粒表达以及产物的检验 质粒转化BL21（DE3）表达宿主菌后，挑取单克隆于37℃振荡培养过夜，将过夜菌以1∶100的体积接种于新的LB培养液中，37℃培养2h