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Runx3基因甲基化及胃癌发生及转移关系 　 作者：李华 李勇 范立侨 赵雪峰 宋振川 赵群 王力利 焦志凯 刘羽　 【摘要】 目的探讨Runx3基因启动子甲基化与胃癌发生发展过程的关系。方法采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测80例胃癌组织及肿瘤周围粘膜组织中Runx3 mRNA的表达,同时用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测Runx3基因启动子甲基化情况。结果80例胃癌组织标本中Runx3基因的表达（0.5971±0.1013）较肿瘤周围组织中表达明显下调（0.8297±0.2912）,差异有统计学意义(Plt;0.05)。正常粘膜组织中未发现有Runx3基因启动子的甲基化,80例胃癌组织中有43例检测到Runx3基因启动子的甲基化,胃癌组织Runx3基因启动子甲基化率显著增高(Plt;0.05)。胃癌标本中Runx3 mRNA的表达与其病理临床特征密切相关，在低分化和有淋巴结转移胃癌组织标本中Runx3 mRNA的表达显著下调(Plt;0.05)。结论Runx3基因启动子甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一并且与胃癌的发生、发展密切相关。 【关键词】 胃癌；Runx3基因；RTPCR；DNA甲基化 1资料与方法 1.1资料 1.1.1标本80例胃癌组织标本取自我院2005年1月~8月的手术切除标本，立即放液氮中速冻，-80℃冻存备用。同时选取癌旁5cm组织作为对照。年龄28~80岁，中位年龄57岁,男45例,女35例,有淋巴结转移45例。所有标本术后均经病理证实。 1.1.2试剂Trizol 购自Invitrogen公司。cDNA第一链反应试剂盒购自Fermentas公司。PCR引物序列由上海生工生物工程公司合成。DNA纯化试剂盒购自Promega公司,氢酯和亚硫酸氢钠购自SIGMA公司。 1.2方法 1.2.1组织总RNA提取将组织标本研磨后，采用Trizol试剂按照说明书提取组织样本总RNA，备用。 1.2.2逆转录多聚合酶链反应（RTPCR）紫外分光光度计定量总RNA,调整浓度为1μｇ/μｌ。按cDNA第一链反应试剂盒说明书采用随机引物法合成cDNA。用GAPDH做为内参照进行PCR。Runx3的引物序列：上游：5’GATGGCAGGCAATGACGA3’，下游：5’TGCTGAAGTGGCTTGTGGT3’, 扩增长度：353bp。GAPDH的引物序列：上游：5’AACGGATTTGGTCGTATTG3’, 下游：5’GGAAGATGGTGATGGGATT3’，扩增长度：208bp。PCR 参数: 94℃ 5min变性; 94℃ 45s, 55℃ 55s, 71℃ 45s, 32个循环; 72℃延伸7min。PCR产物于2%琼脂糖电泳，电压60V，55min。Gel ID凝胶图像分析系统摄片分析测定其光密度。计算各个样本Runx3积分光密度（条带强度× 条带面积)与GAPDH内对照积分光密度的比值, 反映Runx3 mRNA表达的变化。 1.2.3DNA提取、纯化和亚硫酸盐修饰称取150mg标本在未解冻时迅速用眼科剪剪碎,然后按DNA纯化试剂盒说明书提取DNA。取1μg DNA加入50μｌ总体积中, 加2mol/L NaOH使其终浓度为0.2mol/L, 37℃变性处理10min。再加入新鲜配制10mmol/L氢酯20μｌ,520μｌ的亚硫酸氢钠,置于50℃水浴16h,修饰后的DNA用Wizard DNA clean up system纯化,加入NaOH (终浓度0.3mol/L)室温变性5min,加入3mol/L的醋酸钠中和后,乙醇沉淀回收DNA,此DNA溶于50μｌ TE缓冲液中, -20℃贮存备用。 1.2.4甲基化特异性PCR(Methylation 2specific PCR, MSP)甲基化特异性引物上游引物序列为5’ TTACGAGGGGCGGTCGTACGCGGG 3’, 下游引物为5’ AAAACGACCGACGCGAACGCCTCC 3’, 扩增片段为210bp。非甲基化特异性引物上游序列为5’ TTATGAGGGGTGGTTGTATGTGGG 3’, 下游引物为5’ AAAACAACCAACACAAACAACTCC 3’, 扩增片段为210bp,反应体系总体积为25μｌ, 甲基化反应条件为94℃ 5min 预变性，94℃ 30s, 65.6℃ 45s,72℃ 55s,共35个循环, 72℃延伸5min。非甲基化反应条件为94℃ 5min 预变性，94℃ 30s,61.2℃ 45s, 72℃ 55s,共35个循环, 72℃延伸5min。PCR产物5μｌ于1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外线下观察拍照分析。 1.3统计学处