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hTSHR胞膜外区片段真核表达载体构建及表达 　【摘要】 目的: 构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29～100）、 hTSHRe（aa101～278）的真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe, 并在CHO细胞中进行表达。方法: RTPCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO中, 经酶切、 PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达, RTPCR扩增转染细胞的cDNA、 Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。结果: RTPCR分别扩增两个片段的阳性克隆株, 所得片段大小与预期一致, 经Western blot鉴定, 相对分子质量（Mr）分别为11900、 23600左右, 与预期的大小相符。结论: 真核表达载体pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe构建成功, RTPCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达, 为进一步研究pcDNA3.1hTSHRf和pcDNA3.1hTSHRe在体内的基因表达, 建立Graves’病的动物模型奠定了基础。 【关键词】 TSH 受体 真核表达 Graves病 　　人TSHR是一种跨膜性蛋白, 属于G蛋白偶联受体, 具有7次跨膜结构, 体内主要分布在甲状腺滤泡细胞膜上。hTSHR蛋白由764个氨基酸组成, 相对分子质量（Mr）为84500, 分为膜内区、 跨膜区以及膜外区3个部分［1, 2］, 编码hTSHR膜外区的基因长度是1300 bp, 研究表明TSHR是许多自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease, AITD）中主要的自身抗原之一, TSHR膜外区（TSHR extracellular domain, TSHRECD）是其免疫原性区段, 抗TSHR的抗体大多结合于此段。本研究中克隆hTSHRECD氨基端的2个片段编码序列（188～403 bp, 407～904 bp）, 构建其真核表达载体, 并转染CHO细胞,进行稳定表达。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 CHO细胞由中国医学科学院血液病研究所药理室熊东升研究员惠赠,酵母提取物、 胰蛋白胨购自OXOID公司, Hams F12、 G418、 OptiMEM无血清培养基购自Gibco公司; FBS和bTSH购自Sigma公司。真核表达载体pcDNA3.1(D)/V5HisTOPO和感受态E.coli TOP10 购自Invitrogen公司。DNA快速纯化回收试剂盒、 限制性内切酶Hind Ⅲ以及Pyrobest DNA聚合酶购自TaKaRa公司; MMLV逆转录酶试剂盒、 化学发光试剂盒购自Promega公司; 质粒回收纯化试剂盒购自博大泰克公司; TRIzol试剂、 脂质体LipofectamineTM2000 Reagent及小鼠AntiHis单克隆抗体（mAb）购自Invitrogen公司; 引物设计合成由上海英俊公司完成。 　　1.2 方法 　　1.2.1 PCR引物设计与合成 根据GenBank公布的hTSHR cDNA序列（GenBank: 000369）序列分别设计片段188～403 bp的引物F4: 5′cac catg gag tgc cat cag gag ga g3′, R4: 5′act caa att gta gaa gga gtg tg3′; 片段407 bp～940 bp的引物F5: 5′cac catg gtg act cac ata gaa at3′, R5: 5′tgg gta aga aag gtc agc c3′。上游引物的5′端序列起始密码子ATG前加人Kozak序列（划线部分）以提高转录起始的效率［3］。 　　1.2.2 组织材料获取与总RNA的提取 人正常甲状腺组织30 mg, 加入1 mL TRIzol, 匀浆后加入200 μL氯仿, 摇匀, 室温孵育2～3 min, 4℃, 11000 g离心15 min, 取上清水相至新离心管中; 加400 μL异丙醇, 室温孵育10 min, 4℃, 11000 g离心10 min; 弃上清, 用1 mL750 mL/L乙醇洗涤1次, 4℃, 11000 g离心5 min; 弃上清,空气中干燥10 min, 加RNasefree水溶解, 测RNA浓度, -70℃保存。 　　1.2.3 RTPCR 将人甲状腺正常组织RNA, 逆转