RKIP介导ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中作用.docVIP

RKIP介导ERK通路在电磁辐射致海马神经元损伤中作用 　【摘要】 目的: 研究电磁辐射对原代培养海马神经元Raf激酶抑制蛋白(RKIP)和磷酸化ERK表达的影响, 应用MEK的抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用。方法: 体外培养原代海马神经元, 采用XHPM、 SHPM及EMP作为辐射源, 分别建立3种电磁辐射细胞模型。通过免疫荧光标记、 激光扫描共聚焦显微镜检测RKIP和磷酸化ERK的表达; 利用Annexin VPI双标记、 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡与坏死率。结果: 三种电磁辐射后海马神经元RKIP表达均减少, 磷酸化ERK表达均增加, 且胞核移位发生, 辐射组间均未见明显差异; U0126预处理组较单纯辐射组神经元的凋亡与坏死率明显降低, 但仍高于假辐射组。结论: RKIP介导的ERK通路过度激活是电磁辐射致海马神经元凋亡与坏死的重要机制之一, U0126对电磁辐射损伤具有一定防护作用。 【关键词】 电磁辐射 海马神经元 RKIP ERK 原代培养 　　Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein, RKIP)作为调控多种信号转导通路的中心信号蛋白, 在细胞的生长、 分化、 增殖和凋亡中扮演重要角色, 其中RKIP介导的Raf/MEK/ERK信号通路对于肿瘤细胞的存亡至关重要。我们前期的研究发现, 电磁辐射后大鼠海马RKIP表达明显下调［1］, 但是对于RKIP在电磁辐射致海马损伤中的作用机制及其介导的ERK通路在辐射损伤中的作用尚未见报道。为此, 本研究中选用近年来应用较为广泛的X波段高功率微波(Xband high power microwave, XHPM)、 S波段高功率微波(Sband high power microwave, SHPM)及电磁脉冲(electromagnetic pulse, EMP)作为辐射源, 通过细胞培养、 免疫细胞化学染色、 激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)、 Annexin VPI双标记、 流式细胞术(FCM)及图像分析等手段, 研究电磁辐射对原代海马神经元RKIP和磷酸化ERK表达的影响, 并应用MEK的特异性抑制剂U0126探讨RKIP介导的ERK通路在辐射损伤中的作用, 为阐明电磁辐射损伤机制和揭示3种电磁辐射损伤效应的异同提供依据, 并为辐射损伤的防诊治开辟新途径。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 Wistar大鼠, 由军事医学科学院实验动物中心提供; DMEM培养基、 N2 supplement、 B27 supplement均为Invitrogen公司产品; 马血清购自Hyclone公司; 胰蛋白酶、 谷氨酰胺、 阿糖胞苷均为Amersco公司产品; 兔抗神经元特异性烯醇化酶(neuronspecific enolase, NSE)、 兔抗RKIP、 FITC或Cy3标记的羊抗兔IgG抗体均为Santa Cruz公司产品; U0126购自Promega公司; Hoechest33342购自Sigma公司; Annexin V细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司; FCM为美国BD公司产品; LSCM为BioRad公司产品。 　　1.2 方法 　　1.2.1 原代海马神经元培养与鉴定 出生12 h内Wistar大鼠, 无菌分离双侧海马, 经2.5 g/L胰蛋白酶消化, 制备细胞悬液, 以5×108/L密度接种于包被多聚L赖氨酸的塑料培养皿, 培养液含850 mL/L DMEM、 100 mL/L马血清、 10 g/L谷氨酰胺、 青霉素105 U/L、 链霉素105 U/L、 10 g/L N2和20 g/L B27。于37℃、 50 mL/L CO2及饱和湿度的培养箱内培养, 至第3天加入阿糖胞苷(3 mg/L)抑制胶质细胞过度增殖, 24 h后全量换液, 以后每周半量换液2次, 培养至7～10 d用于实验。采用NSE抗体, 以免疫细胞化学ABC法染色进行神经元鉴定。 　　1.2.2 细胞分组与辐射条件 将原代海马神经元随机分为假辐射组(Control)、 EMP组、 SHPM组、 U0126＋SHPM组、 XHPM 组及U0126＋XHPM组, 分别采用HPM和EMP模拟源辐射细胞, SHPM和XHPM平均功率密度均为100 mW/cm2, EMP场强为6×104 V/m, 辐射时间均为4 min。假辐射组进行同等条件伪辐射。 　　1.2.3 U0126给予方法 参照试剂说明书, 于辐射前30 min, 向细胞培养皿中加入MEK的特异性抑制剂U0126, 其终浓度为10 μmol/L。