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RNAi沉默survivin基因对胰腺癌细胞增殖、凋亡及周期影响 　 作者：田维军 赵金伟 宋晓斌 【摘要】 目的 应用RNAi技术沉默胰腺癌细胞株中survivin基因对肿瘤细胞凋亡、细胞周期和增殖的变化。方法 靶向survivin的RNAi载体转染胰腺癌细胞，Western印迹检测基因沉默效果，MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡及细胞周期。结果 survivin基因沉默效率可达85%；MTT检测显示，干扰组survivin沉默细胞增殖抑制与非特异性质粒对照组相比显著增高（Plt;0.01）。流式细胞术显示，干扰组细胞凋亡百分率显著高于非特异性质粒对照组（Plt;0.01）；G2/M期显著高于非特异性质粒对照组（Plt;0.01或Plt;0.05），而S期则显著降低（Plt;0.05）。结论 survivin基因沉默可引起胰腺癌细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖。 【关键词】 RNAi；survivin；细胞凋亡；细胞周期；胰腺癌 胰腺癌的发生、发展以及侵袭、转移是多基因参与、多步骤发生的过程，其中生存素（survivin）是一类在胰腺癌的发生、发展中起非常重要作用的癌基因〔1〕，其参与细胞多种重要生物学过程，包括基因转录调控、胚胎发生、细胞分化、肿瘤形成和转移等〔1，2〕。survivin在胚胎期表达丰富，而在成熟组织中则表达极少或缺失，但在病理情况下，包括胰腺癌的很多恶性肿瘤组织中均发现有survivin的高水平表达，并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力呈正相关〔1，3〕。survivin的过表达和激活不仅与预后不良密切相关，而且能影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，是胰腺癌基因治疗的潜在靶点之一〔4，5〕。本研究选择survivin分子作为干扰靶点，检测沉默该基因后对胰腺癌细胞凋亡和细胞周期的影响，为进一步研究survivin基因在肿瘤细胞生物学特性及免疫抑制中的作用构建技术平台。 　　1 材料与方法 　　1.1 主要试剂 　　人胰腺癌细胞株PC3购自中国科学院上海生物研究所细胞库，以含10%胎牛血清（Hyclone公司）的DMEM（Gibco公司）培养基，37℃，5%CO2孵箱（SANYO）培养。转染试剂LipofectamineTM 2000（美国Gibco公司），ECL化学发光试剂盒（美国Pierce公司），小鼠抗人单克隆survivin抗体（Santa Cruz公司）。干扰质粒pGenesil2、非特异性siRNA（武汉市晶赛生物工程技术有限公司），pGensilsiRNAsurvivin质粒由本室构建。AnnexinV凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。 　　1.2 细胞培养与细胞转染 　　转染前1 d将对数生长期的胰腺癌细胞株PC3以2×105个/孔接种于6孔培养板，细胞铺板在2 ml含血清、不含抗生素的DMEM培养基中，24 h内、细胞融合达40%～60%时进行转染，将siRNA LipofectamineTM2000复合体加到培养板中（转染方法按试剂盒说明书操作），转染体系为500 μl，siRNAs终浓度为100 nmol/L。 　　1.3 Western印迹检测基因沉默效果 　　收集细胞，用PBS缓冲液漂洗3次，加入200 μl 细胞裂解液混匀、冰浴30 min。15 000 r/min离心10 min，以Lowry′s 法行总蛋白定量分析。制备12％分离胶、5％积层胶，上样，在8 V/era电压条件下行SDS聚丙烯酰胺电泳，待溴酚蓝进入分离胶时，将电压提高到15 V/era。电泳结束后，将分离出的蛋白质转至硝酸纤维素膜上（Millipore，USA），5％脱脂奶粉的TBS溶液封闭2 h，鼠抗人单克隆一抗和βactin室温孵育2 h，二抗室温孵育1.5 h，ECL 试剂盒显色，拍照，比较各组灰度变化。分为siRNA干扰组、siRNA干扰对照组(用非特异siRNA LipofectamineTM 2000复合体转染)、空载体组(以空白载体复合体转染)、未转染对照组(以等量培养基处理)作为对照，观察各组干扰效果。 　　1.4 MTT法检测细胞增殖 　　将各组细胞以2 000个/孔的密度接种于96孔板，体积200 μl/孔。分别于转染后24、48、72 h进行MTT检测，酶标仪测定570 μm处OD值，连续测定3 d。每个时间点设5个复孔，根据吸光度值绘制曲线，比较各组细胞生长速度变化。分为siRNA干扰组和非特异性转染对照组。 　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡 　　分别于转染后24、48、72 h收集细胞，冷PBS洗涤2次，－20℃预冷的70%乙醇固定48 h，1 200 r/min离心10 min弃上清，1 000 μl PBS重悬加10 mg/ml RNase 20