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RNA干扰Twist基因对人膀胱癌T24细胞化疗敏感性影响 　 作者：沈彬 管旌旌 胡敬海 王春喜 【摘要】 目的 构建转录因子Twist基因的短发卡状RNA ( shRNA) 质粒，转染人膀胱癌T24细胞株后检测T24细胞对羟基喜树碱（HCPT）的敏感性。方法 体外构建Twist基因shRNA的表达质粒，脂质体法介导将其转染入T24细胞。实验分为正常对照组、非特异性转染组和特异性转染组。采用RTPCR法和Western印迹法检测转染后Twist mRNA 及蛋白的表达。使用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)及流式细胞术（FCM)测定Twist shRNA 转染T24细胞后细胞对HCPT敏感性的改变。结果 Twist shRNA 转染组细胞Twist mRNA和蛋白的表达与其他两组相比明显下调(P＜0.05)；HCPT敏感性与正常对照组相比明显提高(P＜0.05)。结论 靶向Twist 基因的序列特异性shRNA 可增强T24细胞对HCPT的敏感性。 【关键词】 RNA干扰;羟基喜树碱;短发卡样RNA;Twist 基因 膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤,高发年龄为50～70岁，复发率高是其显著特点,因此绝大多数患者在进行肿瘤切除手术后需进行膀胱灌注化疗。羟基喜树碱(HCPT)是从珙桐科植物喜树中提取的微量生物碱，作为腔内灌注治疗膀胱癌的常用药,取得了一定的治疗和预防效果。随着基因治疗技术研究的逐步深入，大家逐渐认识其存在着局限性。为了弥补基因治疗的不足，本实验用Twist基因联合HCPT 对人膀胱癌T24细胞的体外杀伤作用进行比较,为基因治疗联合化疗药物治疗膀胱癌提供一定的实验依据。 1 材料与方法 1.1 材料 Twist短发卡状RNA(shRNA)已由本实验室构建成功并证实可下调T24细胞中Twist基因mRNA和蛋白的表达〔1〕。脂质体转染试剂(Lipofectami2000)购于Invitrogen公司。膀胱癌T24细胞株购自中科院上海细胞研究所细胞库，胎牛血清和IMDM细胞培养基购自天津TBD公司。HCPT针剂由湖北黄石飞云制药有限公司出品。细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。 1.2 实验方法 1.2.1 Twist shRNA质粒构建和筛选〔1〕 Twist shRNA干扰序列：GCTGAGCAAGATTCAGACCCT。Twist基因引物:上游5′ GGGAGTCCGCAGTCTTACGA3′，下游5′CCAGACCGAGAAGGCGTAGC3′，表达长度277 bp。人内参GAPDH 基因引物序列:上游 5′AGCCACATCGCTCAGACAC3′，下游 5′GAGGCATTGCTGATGATCTTG3′。 1.2.2 MTT法测定细胞对HCPT的药物敏感性 实验分为正常细胞组、转染阴性对照质粒细胞组和转染Twist shRNA细胞组。取对数生长期细胞接种于96 孔板(1×104cells/孔)，加160 μl培养液37 ℃培养24 h 后加入终浓度为0.01、0.1、1、5、10、50、100 mg/L HCPT，每个浓度设6个复孔;继续培养48 h后加入20 μl(5 g/L)MTT。再培养4 h后尽量吸干培养液,加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解10～15 min。上酶联免疫分析仪测每孔吸光度值(A值)，波长490 nm，计算HCPT半数抑制浓度(IC50),实验重复3 次。抑制率=〔(阴性对照A值-实验组A值)/阴性对照A值〕×100%。以药物浓度数值为横轴,抑制率为纵轴绘制浓度效应曲线。 1.2.3 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况 收集0.1 mg/L HCPT处理的不同组膀胱癌细胞,PBS洗涤2次，按照试剂盒说明书依次加入Annexin V和碘化丙碇(PI)溶液,避光作用15 min。上COULTER EPICS XL型流式细胞分析仪检测细胞凋亡,其中每次至少计数10 000 个细胞,每个样品分别做2次,采用Multicycle分析软件分析。 1.3 统计学分析 采用SPSS11.5 统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。 2 结 果 2.1 MTT法测定T24细胞对HCPT的药物敏感性 MTT结果显示随HCPT浓度的增加,正常细胞组、转染阴性对照质粒组和转染Twist shRNA组细胞的存活率均呈下降趋势,具有明显的剂量 效应关系(图1)。在设计的HCPT浓度范围内,转染Twist shRNA组细胞存活率均低于两对照组细胞。转染Twist shRNA组细胞对HCPT的IC50明显降低,为(1.09±0.23)mg/L，与正常细胞组(2.85±0.31)mg/L和转染阴性对照质粒组(2.68 ±0.3