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RNAi抑制胰腺癌细胞株VEGF表达实验探究 　 作者：赵鑫,李德春,张子祥,赵华,岑建农 【关键词】 RNA干扰；Panc1；VEGF；PCR；ELISA 　　0引言 　　血管内皮细胞生长因子(VEGF)是体内一种内皮细胞特有的有丝分裂原，调控血管内皮细胞的增殖、迁移、水解基膜和血管构建，诱发血管期的启动[1，2] 。RNA干扰(RNAi)是一种重要的转录后基因沉默机制[3]。本实验拟构建以VEGF基因为靶向的RNA干扰质粒，沉默胰腺癌Panc1细胞株中VEGF基因的表达，为抑制胰腺癌血管生成提供基础。 　　1材料与方法 　　1.1主要材料siRNA真核表达载体pGCsiU6/Neo/GFP和阴性对照载体购自上海吉凯基因化学公司，abl、VEGF基因PCR引物及探针由上海生工公司合成；人VEGF ELISA试剂盒为美国Ramp;D公司产品。 　　1.2方法 　　1.2.1pGCsiVEGF的构建与细胞转染参考siRNA的设计策略，从VEGF基因第三外显子上挑选长为19个碱基的特异性寡核苷酸序列(5’GGAGTACCCTGATGAGATC3′)，合成其发卡样两端配对siRNA寡核苷酸链，中间以9个脱氧核苷酸的Loop相连。取合成两条shRNA的模板单链，退火形成siRNA载体插入片断，见图1。取空质粒用BamHI和HindIII行双酶切，电泳，切胶，回收线性质粒，纯化。将上述片断接入线性化质粒，得到重组子命名为pGCsiVEGF。对其进行测序。脂质体法将pGCsiVEGF和阴性对照质粒转染Panc1细胞。转染后的细胞用含G418培养液筛选2周后挑取阳性单克隆继续培养4周，用流式细胞仪检测筛选后的GFP表达率。 　　1.2.2Real Time PCR和ELISA取转染阳性克隆细胞，提取细胞内总RNA，逆转录合成cDNA链。以看家基因abl的表达作为内参，abl和VEGF的引物及Taqman探针序列如下：Abl 引物：正义5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA  3′；反义5′ACTCAGACCCTGAGGCTCAAAG  3′； abl Taqman 探针：5′FAMAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATTAMARA  3′VEGF 引物：正义5′GGGCCTCCGAAACCATGAACTT 3′；反义5′CGCATCAGGGGCACACAG  3′； VEGF Taqman 探针：5′ FAMCACCATGCAGATTATGCGGATCAAACCTAMARA  3′扩增条件：95℃ 5min，95℃ 20s，60℃ 1min，采集荧光信号，50个循环。对样本设复管检测，取平均值作为目的基因表达水平。abl、VEGF基因拷贝数按照江苏省血研所已建立的方法计算，以同一份样本VEGF基因拷贝数×102/abl基因拷贝数来计算VEGF基因表达水平，将未转染Panc1细胞（对照）设定为100%，计算出各组干扰效率。按照第219～280位碱基为插入片段序列，其中第225～271位碱基为siRNA目的片段序列图3流式细胞仪检测GFP表达率ELISA试剂盒操作说明，450nm可见光比色得吸光度(A)值，作为纵坐标，标准品浓度(pg/m1)为横坐标，绘制标准曲线，根据标本的A值得出上清液VEGF浓度。将未转染Panc1细胞（对照）设定为100％，计算出各组相对含量。 　　图1siRNA载体插入片断序列（略） 　　图2重组质粒的测序鉴定（略） 　　1.2.3统计学处理采用SPSS10.0统计软件，两均数比较的t检验，以Plt;0.05为具有统计学差异。 　　2结果 　　2.1重组质粒测序表明目的片断已克隆入载体，表示质粒构建成功。截取部分测序结果见图2。 　　　2.2转染阳性克隆细胞GFP表达率G418筛选2周后挑取转染阳性单克隆细胞培养4周，Panc1/阴性对照载体和Panc1/重组子的GFP表达率分别为90.3％、94.7％，见图3。 　　2.3Real Time PCR和ELISA结果图4显示VEGF基因实时定量PCR检测标准曲线，不同实验间误差＜5%。Real Time PCR和ELISA数据见表1。 　　表1实时定量PCR检测各组的VEGF干扰效率及ELISA检测VEGF表达相对含量标本VEGF基因相对含量（略） 　　注:★表示与Panc1组比较差异具有统计学意义,Plt;0.01;▲表示与Negative组比较差异具有统计学意义,Plt;0.01 　　图4VEGF基因实时定量PCR检测标准曲线（略） 　　3讨论 　　肿瘤血管生成对实体瘤的生长起重要作用，血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的促血管生成因子，通过促进血管内皮细胞的分裂和增殖、增加血管