RAGE、NF-κB反义RNA单-双基因共表达载体构建及序列测定.docVIP

RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体构建及序列测定 　 作者：游捷 ，黄清玲 ，林旭 ，刘礼斌 ，林建银 【摘要】 目的 构建晚期糖化终产物受体（RAGE）、核因子-κB（NF-κB）反义RNA单/双基因共表达载体。 方法 从人脐静脉内皮细胞ECV304中提取总RNA，RT-PCR扩增RAGE基因片段;从糖尿病人外周血单核细胞提取总RNA，RT-PCR扩增NF-κB p65基因片段。分别克隆入PGEM-T载体，酶切鉴定阳性克隆，再经PCR反应获得多量的RAGE，NF-κB基因片段，反向插入双启动子真核表达载体pBudCE4.1，构建RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体。 结果 RT-PCR扩增出RAGE基因片段328bp，扩增出NF-κB p65基因片段364bp。测序分析证实目的基因片段正确反向插入3个重组载体。 结论 RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体构建成功。 【关键词】 RNA，反义;基因表达调控;糖基化终产物，高级;糖基化;NF-κB;基因;DNA，重组;遗传载体 　晚期糖化终产物（AGE）在糖尿病、肾功能衰竭、衰老、炎症等情况下明显增加。AGE主要通过晚期糖化终产物受体（RAGE）介导病理情况。目前认为，AGE-RAGE作用后可引起核因子（NF）-κB的激活。NF-κB是调节RAGE表达的一个启动子，因此NF-κB的激活作为一种正反馈，进一步促进了AGE与RAGE的结合 ［1-2］ 。笔者构建RAGE、NF-κB反义RNA单/双基因共表达载体，为今后进一步研究阻断AGE-RAGE的策略打下基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 E.coli Top 10 、PGEM-T载体、双启动子型真核表达载体pBudCE4.1、高保真PCR酶、dNTP、一步法RT-PCR试剂盒、Trizol、Zeocin、IPTG、X-Gal、DEPC（Invitrogen公司）。限制性内切酶、T 4 DNA连接酶（Biolab公司）。胶回收试剂盒、小量质粒抽提试剂盒（上海华舜生物制品公司）。人脐静脉内皮细胞ECV304（中科院上海细胞生物研究所）。上海博亚生物技术有限公司合成引物及测序。 　　1.2 方法 　　1.2.1 根据GeneBank报道的人RAGE基因（GeneBank登录号AB036432）、人NF-κB p65基因（GeneBank登录号M62399）设计引物，扩增RAGE基因序列的14-342位的328bp序列。扩增NF-κB p65基因序列的14-378位的364bp序列。PCR引物如下: 　　RAGE F:5’-GGG GTA CCA AGG AAG CAG GTA GGC AGC C-3’ 　　RAGE R:5’-CCG CTC GAA TCC ATT CCT GTT CAT CTG C-3’ 　　NF-κB p65F:5’-CGC GGA TCC TGG CTC GTC TGT AGT GCA CG-3’ 　　NF-κB p65R5’-CCC AAG CTT TAG AAG CCA TCC CGG CAG TC-3’ 　　1.2.2 RAGE、NF-κB基因的体外扩增及扩增片段的回收 Trizol试剂提取ECV304总RNA，RT-PCR扩增RAGE基因片段，反应体系:总体积50μL由引物RAGE R，RAGE F各3μL、RNA3μL、dNTP1μL、5×buffer缓冲液10μL、RT/Taq酶1μL、DEPC水26.5μL构成。反应条件:55℃逆转录反应60min→94℃变性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循环，72℃延伸7min。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶中电泳。另取一名血糖控制较差、无急性并发症的糖尿病人外周血有核细胞提取总RNA用于扩增NF-κB基因片段，RT-PCR反应体系、反应条件同上。胶回收试剂盒回收2种目的基因片段。 　　1.2.3 RAGE、NF-κB基因PGEM-T载体克隆 将目的基因RAGE、NF-κB片段与PGEM-T连接，并转化感受态细胞E.coli Top 10 ，将菌液涂抹至预先制备含IPTG/X-Gal/氨苄青霉素的LB平板上，蓝白筛选，扩增阳性克隆并小量抽提质粒，xhoⅠ、kpnⅠ（RAGE）/HindⅢ、BamH I（NF-κB）双酶切鉴定。阳性质粒命名为PGEM-T/RAGE，PGEM-T/NF-κB。 　　1.2.4 pBudCE4.1/RAGE重组载体的构建 取PGEM-T/RAGE质粒DNA，用引物RAGE R、RAGE F扩增RAGE目的基因。PCR反应体系:总体积50μL，由引物各3μL，质粒DNA2μL，dNTP1μL，10×buffer缓冲