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RAI16蛋白合成肽多克隆抗体制备及初步应用 　 作者：雒喜忠, 王阁, 许文, 李琼, 陈川, 张志敏, 胡庆, 王东 【摘要】 目的: 制备RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体, 并进行初步鉴定和应用, 为研究RAI16蛋白的功能及作用机制获得重要的实验工具。方法: 应用Fmoc法化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽, 经C18的RPHPLC纯化后, 通过高碘酸钠法将纯化的RAI16蛋白的多肽与KLH交联; 皮下注射抗原免疫新西兰纯种大耳白兔, 加强免疫得到抗血清, 应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、 免疫组化、 Western blot等初步鉴定和应用。结果: 化学合成RAI16蛋白N端第44～55位氨基酸的多肽, 纯化后多肽纯度为96％ , 达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联, 用于免疫动物。经纯化后的抗体效价为1∶125 000。该多肽抗体可特异识别人脾脏组织中相对分子质量(Mr)约为55 000的RAI16蛋白。结论: 所制备的多克隆抗体能与天然RAI16蛋白发生特异性反应, 可应用于ELISA、 免疫组化、 免疫沉淀和Western blot等实验, 为确定RAI16蛋白的组织分布和亚细胞定位、 研究RAI16蛋白的功能及作用机制提供了重要的实验工具。 【关键词】 视黄酸诱导蛋白16; 多肽抗原; 多克隆抗体; ELISA; 亲和层析 近几年在对视黄酸（RA）作用研究中发现了视黄酸诱导蛋白（RAI）系列基因, 但尚无具体完整的结构和功能研究的相关报道, 只是推测RAI 系列蛋白可能是一种“新型”的胞内参与信号转导转录调控的蛋白质家族。视黄酸诱导蛋白16（RAI16）蛋白作为家族成员之一, 了解其结构功能, 对认识整个家族特征具有重要的意义。 我们前期工作以Tec激酶结构域作为“钓饵”蛋白, 利用酵母双杂交技术筛选构建于转录激活结构域(AD)载体的人胎肝cDNA文库, 经营养缺陷选择及诱导筛选及初步鉴定, 发现并确证了一个新的阳性克隆, 对筛库所得基因片段测序经BLAST比对分析后, 确定为RAI16(Homo sapiens retinoic acid induced 16)基因, 已被GenBank收录(编号为BC052237), 组织来源为脑Ⅳ型星状细胞瘤, 其编码蛋白为RAI16。并由此推译出其蛋白质一级结构, 对其功能区、 信号肽、 亚细胞定位、 二级结构及亲疏水性等进行了分析。研究表明, RAI16蛋白是一种定位于胞质内内质网上的分泌型的球形信号蛋白, RAI16蛋白很可能在肝干细胞和肝癌诱导分化过程中, 作为RA诱导蛋白被信号蛋白分子募集至胞质内, 通过磷酸化、 去磷酸化、 豆蔻酰化、 酰胺化等修饰, 通过不同的活化形式和剪切方式以及胞质与胞核间的移位, 完成其在信号转导中的重要角色［1］。因此推测RAI16蛋白可能为RA信号通路中一类胞质内重要“新”的信号蛋白分子。结合前期工作, 根据人RAI16蛋白的cDNA 编码的氨基酸序列, 结合计算机分子模拟设计11个氨基酸多肽, 经与载体蛋白KLH 偶联作为免疫原, 免疫家兔制备多克隆抗体, 并经亲和层析进行纯化。从而制备出可与天然RAI16蛋白发生特异性结合反应的抗RAI16蛋白的合成肽多克隆抗体, 为进一步深入研究RAI16蛋白的功能、 阐明RAI16在肝癌细胞诱导分化信号转导通路中的作用和明确RAI16与Tec蛋白之间的相互作用机制作奠定了基础。 1 材料和方法 1.1 材料 免疫和筛选用的RAI16蛋白cDNA编码的氨基酸序列N端第44～55位氨基酸的多肽为化学合成, 免疫用抗原C端交联载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH), 均由上海艾比玛特公司采用合成肽自动合成仪合成。Methylated bovine serum albumin(MBS)和福氏佐剂为Sigma公司产品。HiTrapTM Protein G HP抗体纯化柱为Amersham公司产品。羊抗兔IgGHRP和 DAB为北京中杉金桥生物技术公司产品。ECL反应试剂盒为Amersham公司产品。SephadexTMG25 脱盐柱(Amersham Biosciences, Sweden)、 小牛血清、 牛血清白蛋白、 loading buffer为TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司产品; 免疫用兔子系新西兰纯种白兔2只（1.5个月左右, 雄性健壮, 质量为2 000～ 2 200 g）, 由上海申旺实验动物中心提供。 1．2 方法 1.2.1 RAI16合成肽的设计 结合前期的研究, 从GenBank中检索到RAI16蛋白cDNA全长序列, 利用DNAstar软件根据抗原指数(An