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HT036是纤维化相关基因P311相互作用蛋白 　作者：彭旭，谭江琳，袁顺宗，贺伟峰，陈烯伟，罗高兴，吴军 【摘要】 目的 利用激光共聚焦显微镜观察未知蛋白(HT036)与纤维化相关蛋白(P311)的细胞内表达与共定位。方法 构建带绿色荧光的HT036真核表达载体，经鉴定正确后，与前期构建带红色荧光的P311真核表达载体共转染人胚肾上皮细胞株(HEK293)，同时共转染空载体做对照，激光共聚焦显微镜下观察蛋白在细胞内表达、分布和共定位。结果 HT036真核表达载体经聚合酶链反应(PCR)、双酶切和测序鉴定正确，与P311共转染HEK293细胞后，激光共聚焦显微镜观察到绿色和红色荧光表达。HT036和P311主要分布在细胞胞浆，两者在HEK293细胞中存在共定位，而对照组则无该现象。结论 通过酵母双杂交筛选出的P311相互作用蛋白HT036，在活体细胞内存在空间上的共定位，进一步证明它们之间的相互作用，为探讨P311纤维化机制提供新的切入点。 【关键词】 创伤修复;蛋白;基因;成纤维细胞;瘢痕 　　Abstract: Objective To observe the intracellular expression and the colocation of HT036 with P311 in human embryo kidney cell line.Methods The encoding sequence of HT036 was amplified and cloned into the eukaryotic expression plasmid pEGFPN2.The construction was verified by sequencing and then cotransfected into HEK293 with pDsRedP311.The expression products were visualized and analyzed by confocal microscope.Results The vector was successfully constructed.The confocal microscope scanning showed that the fluorescence fusion proteins mainly distributed in cytoplasm and there was colocation between the two proteins.Conclusion This study further confirmes the issue that HT036 and P311 may interact with each other in vitro and play role in hypertrophic scar formation. 　　Key words:trauma repair;protein;gene;fibroblast;scar 　　创伤修复过程中,由于全身和局部因素的影响，常可导致以细胞外基质过度沉积为特征的增生性瘢痕。它是一类特发于人类的增生性疾病，由于发病机制的多样性和理想动物模型的缺乏，至今仍是创伤修复领域研究的难点和热点。纤维化相关蛋白(P311)基因是本研究小组利用基因芯片技术从早期增生性瘢痕组织中筛选出的显著高表达差异基因[1]，研究发现P311基因参与神经元损伤修复和成纤维细胞向肌成纤维细胞转化过程[2，3]。为了进一步探讨P311基因在创伤修复过程中,尤其是增生性瘢痕发生发展中的作用机制及可能存在的上下游调控模式，我们利用酵母双杂交系统筛选了人肝cDNA文库，得到了其中能与P311相互作用的HT036蛋白[4]。HT036为一未知功能蛋白，国内外鲜有文献报道。人胚肾293细胞作为最常用的工具细胞，具有表达稳定和易转染特性。本实验通过构建带绿色荧光的HT036融合表达载体，与前期构建的带红色荧光的P311融合表达载体共转染人胚肾293细胞，验证HT036与P311之间的相互作用。 　　材料与方法 　　1 主要材料和试剂 　　HEK293细胞、含HT036编码基因重组载体pACT2HT036、大肠杆菌菌株DH5、含绿色和红色pEGFPN2和pDsRedN1真核表达载体(本室保存)。P311红色荧光融合蛋白表达载体(pDsRedp311)(本室袁顺宗博士构建并保存)。凝胶回收试剂盒(Vgene产品);质粒提取试剂盒(Omega产品);限制性核酸内切酶EcoRⅠ和SalⅠ 、T4DNA连接酶、PCR反应试剂盒(大连宝生物公司);DMEM和小牛血清(Gibco公司);脂质体Lipofetamine 20