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蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用 中文摘要 中文摘要 1 TALENs 目的：探讨蓝白斑筛选技术在生物医学方面的新应用：（ ） （transcriptionactivator-likeeffectornucleases）活性检测和脱靶效应评估；（2）检 测EGFR基因外显子19碱基缺失突变新方法。 方法：设计合成一系列片段长度小于150bp的插入片段，将插入片段与两种 T/A pGEM-TEasyvector pTrueBluevector 克隆载体（ 和 ，具有不同的插入位点， 7 11 36 分别位于密码子 和另一个是密码子 和 之间）连接，进行分子克隆，进一 步观察菌落颜色并通过测序验证；人工构建基于蓝白斑筛选的含有TALENs靶序 列的报告质粒，进一步提出一种原核水平检测TALENs有效性方法的可能性；设 计一组特异性PCR 引物，以样本DNA（如人工构建的EGFR野生型、突变型质粒、 肿瘤组织DNA、血中游离DNA等）为模板进行PCR，进一步进行分子克隆。结 合蓝白斑筛选，人为改变阅读框架，致使野生型阅读框架中含有终止密码子TAA， 缺失突变型因丢失一段核酸片段而不含有终止密码子TAA，从而通过观察菌落的 颜色来确定样品有无EGFR基因外显子19的碱基缺失突变。 结论：基于两种不同插入位点的 TA 克隆载体（pGEM-T Easy vector 和 pTrueBluevector 3 3 ），若插入片段若是 的整数倍则菌落呈蓝色；若是 的非整数倍 则菌落呈白色。因此，理论上插入或缺失突变若导致LacZ 阅读框移码则呈现菌落 蓝色变为白色的现象。成功构建2种含有TALENs靶序列的报告质粒，2种质粒的 LacZ 阅读框分别为移码与非移码，对应菌落颜色为白色、蓝色；在此基础上提出 一种检测TALENs有效性的方法，即当TALENs特异性剪切蓝白斑筛选载体上的 靶序列时，导致多肽阅读框的非移码与移码变换，从而共转化后菌落颜色改变。 该体系还可广泛应用于锌指蛋白核酸酶（zincfingernucleases，ZFNs），CRISPR-cas 系统 （CRISPR–Cassystems）有效性检测。分别以人工构建的EGFR野生型、突 变型质粒、肺癌肿瘤组织基因组DNA为模板进行PCR、分子克隆，结果显示野生 型插入片段分子克隆的菌落为白色，突变型插入片段分子克隆的菌落为蓝色。 TAcloning TALENs EGFR 关键词：蓝白斑筛选； ；反因子蛋白酶（ ）； 基因 作 者：潘韵芝 指导教师：李 凯 教授 I 英文摘要 蓝白斑筛选技术的改进及其生物医学应用 Beta-galBasedBlue/WhiteScreeningAssayandIts BioligicalandBiomedicalApplications Abstract Objective：To investigate the bioligical and biomedical applications of beta-gal based blue/white colony screening