茶树被茶尺蠖取食诱导的一个13-脂氧合酶基因的分离、功能鉴定与表达分析.pdfVIP

图表清单 图 1­1 脂氧合酶活性中心结构图 图 1­2  脂氧合酶家族类型 图 1­3 脂氧合酶亚细胞定位 图 1­4  亚麻酸代谢途径 图2­1 技术路线 图3­1   3′RACE 反应原理 图3­2   5′RACE 反应原理 图4­1 茶叶总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图 图4­2 3′/5′RACE 扩增产物 图4­3 CsLOX3全长 cDNA 的扩增 图4­4 CsLOX3 的ORF核酸序列 图4­5 CsLOX1, CsLOX2和  CsLOX3 的氨基酸序列比对及保守区 图4­6  多种植物的 LOXs进化树分析 图4­7  多种植物的三类 LOXs氨基酸序列比对 图4­8 CsLOX3全长 cDNA 的扩增 图4­9 菌落 PCR 鉴定重组子 图4­10 CsLOX3 原核表达载体的构建 图4­11 不同诱导时间的 SDS­PAGE 分析 图4­12 不同 IPTG浓度诱导的 SDS­PAGE 分析 图4­13 纯化后的 His­ CsLOX3  图4­14 不同温度与 pH 对 CsLOX3酶活性的影响 图4­15 纯化后的 CsLOX3酶活产物分析 图4­16 荧光定量 PCR熔解峰及标准曲线 图4­17 茶树果实发育及茶花开花过程 CsLOXs 的 Real­time PCR 分析 图4­18 不同品种茶叶被茶尺蠖或机械损伤后 CsLOXs 的Real­time PCR 分析 图4­19 茶叶被机械损伤后 CsLOXs 的Real­time PCR 分析 图4­20  用 MeJA 与 SA 处理茶叶后 CsLOX3 的Real­time PCR 分析 表 3­1  茶叶中 CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3 引物序列及产物大小 表 4­1  分光光度计检测 RNA  表 4­2  分光光度计检测 cDNA 1 文献综述  1.1 植物脂氧合酶的基本特征  1.1.1 脂氧合酶的生化特征 脂氧合酶(LOX，EC2)是一种含非血红素铁的蛋白质，可催化多不饱和 脂肪酸(PUFAs)的过氧化， 在植物体内发挥酶的活性时以亚油酸 （LA） 和亚麻酸 （LeA） 为主要底物，研究表明植物中 LOX 的蛋白分子量为 94­104 KD，而动物中为 75­80  [1]  KD  。LOX 具有 38个保守的氨基酸残基，组氨酸(His)是 LOX 结合铁离子的必要因 子，在 LOX 发挥酶的催化活性中起作用，经 X 射线晶体结构和光谱研究显示， LOX  2+  3+  2+  活性中心为 Fe  离子,但活化态为 Fe  ，中心离子Fe  通常与 3个 His 的咪唑氮、1个 异亮氨酸(Ile)的羧基氧配位，不同来源的 LOX 第 5 配位原子不同，第 6 配位点一般 [1,2]  空缺或以小分子 H O配位，整个配合物呈变形八面体构型  。(图 1­1)  2 图 1­1 脂氧合酶活性中心结构图（引自文献 1）  Fig. 1­1The activitycenter of LOXs 1.1.2脂氧合酶的分布  LOX普遍存在于与动物和植物中，但也有分布在低等生物(如藻类)中的。植物中 的 LOX 广泛分布于根、茎、芽、叶、花、果实、种子等器官，且不同器官中各具有 [3]  不同的表达丰度  。亚细胞定位研究表明，植物中的 LOX 主要存在于脂体、叶绿体、 液泡、微粒体、质膜及胞浆。例如，大豆和黄瓜中的 LOX 既可以以可溶性的形式存 在于胞浆和液泡中，也可以以跨膜蛋白的形式存在于脂体膜和质膜上 [3, 4] 。草莓的  [5]  LOX 则在叶绿体、微粒体和细胞质中都有分布  。LOX 存在的部位不同意味着功能