微生物标准操作规程三1.docVIP

XXX人民医院检验科微生物室 标准操作文件 文件编号：JY-WSW-SOP-007 版本号：2007 第1次修改 编写者：XXX XXX 审核者：XXX 修订日期：2012年1月15日 页码：第 1 页 共 2 页 厌氧菌属检验标准操作规程 1．概述 厌氧菌广泛存在于外界环境和人体的口腔、肠道和女性生殖道等部位，常引起内源性感染。据文献报道，约60％的临床感染有厌氧菌参与，且大多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。 2．标本类型 脓胸及未破溃的脓肿、肺分泌物、血液标本、窦道、深部脓肿等的标本。 3．检验流程 3.1 形态与染色 标本涂片、革兰染色、镜检，观察细菌的形态和染色性，并估计标本中大致的含菌量，可用“少量”“十”“++”“+++”“++++”表示。镜检不仅能反映各种厌氧菌特殊形态，同时也能为鉴定厌氧菌提供参考和依据。如脆弱拟杆菌菌体细长，两端尖；韦荣球菌是极小的革兰阴性球菌。同时厌氧菌芽胞的位置、形态、大小对鉴定很有意义，必要时作芽胞形成试验。例如，芽胞在菌体极端且大于菌体呈鼓槌状，是破伤风梭菌的特征。根据厌氧菌的特殊形态，可初步确定有无厌氧菌感染，及时向临床医师发出一级报告，建议采用哪类药物。 3.2 培养特性 一般标本接种3个血琼脂平板，分别放置于有氧、无氧和含5％～10％C02环境中培养。如果只要求检出厌氧菌，只需接种1个厌氧血琼脂平板，也可增加1个相应的选择厌氧血琼脂平板。为便于在混合培养中及早发现厌氧菌，一般将标本分3段划线接种，在第1和第2段交界处贴1张甲硝唑(5 mg/片)纸片，若出现隐约抑菌圈，则提示有厌氧菌生长。 不同厌氧菌的生长速度和菌落形态各异，色素也有不同，荧光产生与否也有助于鉴定，根据上述特征，可初步推测厌氧菌的种类。 3.2.1 革兰阴性杆菌 在BBE琼脂平板上有灰黑色、直径1 mm的菌落，菌落周围有黑色的晕，可初步鉴定为脆弱拟杆菌。 在卡那万古溶血琼脂平板上，有棕色或黑色菌落，或用伍德灯照射有砖红色荧光者，为产黑素普雷沃菌。 菌落沉人琼脂内，使培养基表面留有小坑者，可能是解脲拟杆菌和纤细拟杆菌。菌落表面有小斑点，或如面包屑，结合涂片所见，可初步鉴定为具核梭杆菌。 3.2.2 革兰阴性球菌 菌体很小，排列成双、短链或小堆，菌落小，不透明，可能是小韦荣球菌。 3.2.3 革兰阳性球菌 排列成长短不等的链，可能是消化链球菌。 3.2.4 革兰阳性无芽胞杆菌 臼齿形、粗糙，结核脓样分泌物中有硫黄样颗粒，可能是放线菌。 菌体呈X、Y、V排列，菌落小，灰白，不透明，可能是丙酸杆菌。 3.2.5革兰阳性芽胞杆菌 只要见有芽胞，即可鉴定为梭菌属。菌落有双环溶血，卵黄平 皿上卵磷脂酶试验和Nagler试验阳性，涂片染色为革兰阳性短粗杆菌，有芽胞，有荚膜，可鉴定为产气荚膜梭菌。 3．3生化反应 可依据厌氧菌的菌体染色形态、菌落特性以及对某些抗生素的敏感性作出初步鉴定。最后鉴定则要进行生化反应及终末代谢产物等检查。 生化试验主要包括多种糖类发酵试验、吲哚试验、硝酸盐还原试验、触酶试验、卵磷脂酶试验、脂酶试验、明胶液化试验及胆汁肉汤生长试验和硫化氢试验等。目前用于厌氧菌快速鉴定有胞外酶试验，4小时后即可观察结果；自动微生物鉴定系统，如VITEK-ANI、MicroScan—ANI等也可鉴定厌氧细菌。 3.4 鉴别要点 3.4.1 在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下列事项：①厌氧菌标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝(厌氧菌暴露于空气中时间太长可死亡)，务必在30分钟内完成，同时应避免正常菌群的污染。②培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。③若菌落太小，需用放大镜观察菌落。④作耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4～5个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。⑤如作胞外酶鉴定，一定要有足够的菌液浓度。 3.4.2 耐氧试验 当厌氧平板上有细菌生长时，为了确定是否为厌氧菌，必须做耐氧试验。从每个琼脂平板上挑取4～5个性状不同的菌落，每个菌落分别转种于2块需氧血琼脂平板和1块厌氧血琼脂平板(每个琼脂平板可划4～6区，每区种一个可疑菌落)，然后将平板分别放置在需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。 3.4.3 凡在厌氧环境生长，而在需氧和二氧化碳环境中不生长的细菌为专性厌氧菌；在需氧和厌氧环境中均能生长者为兼性厌氧菌(B区)；在需氧和二氧化碳环境中生长，而在厌氧环境中不生长者为专性需氧菌(C区)；在需氧、厌氧环境中均不生长或生长不佳，而在二氧化碳环境中生长良好的细菌为需二氧化碳菌(D区)。