吉林大学实验课件-分子生物学实验基本技术训练.pptVIP

PCR技术（多聚酶链式反应） PCR是采用分子技术模拟核酸在体内的复制，实现DNA体外扩增，以获得大量DNA片段供研究需要。 94℃ 4min 94℃ 30S 50℃ 30S 30个循环 72℃ 60S 72℃ 10min 4℃ 保存 End 电泳技术（琼脂糖电泳） 分类： 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 醋酸纤维膜电泳 …… 琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶的异同 琼脂糖凝胶浓度与线性DNA的最佳分辨范围 在DNA双螺旋结构中碱基处于双螺旋结构的内部，呈平面结构，垂直于螺旋轴成对排列。糖基—磷酸脂基构成主链暴露在外表面，并带有磷酸脂基的负电荷。 DNA分子电泳时的迁移速度与凝胶孔径和所带电荷量成正比，与分子大小成反比。 样品缓冲液： 盐类（维持样品）、甘油（增加重量从而使样品下沉至点样孔）、以及示踪染料（以便监测电泳进程）。例如 6×Loading Buffer：30%(v/v)甘油，0.25%（w/v) 溴酚蓝，0.25%（w/v)二甲苯腈蓝，蒸馏水配置。 电泳缓冲液： 　凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致． 　琼脂糖凝胶电泳最常用的缓冲液是TAE (Tris-醋酸－EDTA）与TBE (Tris-硼酸－EDTA）。 电源：稳压、稳流、稳功率。 样品制备 （1）适用于琼脂糖电泳的样品可以是基因组DNA、质粒和PCR产物等大分子。 （2）样品必须与上样缓冲液混合均匀，以保证样品带电荷。 琼脂糖凝胶的制备 （1）将铺胶槽调成水平。 （2）准确称取一定质量的琼脂糖放入锥形瓶中，量取30ml 1×电泳缓冲液倒入锥形瓶，瓶口倒扣一个小烧杯。 （3）将锥形放入微波炉中加热煮沸3次至琼脂糖全部融化透明，摇匀。加热时避免凝胶溶液爆沸。 （4）待凝胶冷却至50～60℃时加入染料，混匀后匀速倒入胶托中。倒胶时避免温度过低防止凝胶凝固结块或出现气泡。若凝胶出现气泡则不允许使用。 （5）小心将梳子插在胶托中，待凝胶完全凝固后再拔出梳子。 （6）将凝胶放入电泳槽中，并向电泳槽中倒入1×电泳缓冲液，液面高过胶面2～5mm。 加样和电泳 　（１）取一只PE手套，用移液器在上面点上上样缓冲液，然后取样品使其与上样缓冲液混合均匀点在胶孔中。　 （２）标准分子量标记直接点在胶孔中。 　（３）盖好电泳槽盖，正确连好导线。 　（4）在电泳时，为了获得电泳分离DNA的最大分辨率，电场强度不应高于5 V/cm 凝胶成像 （１）待前沿指示剂距凝胶前沿约1cm是停止电泳。 （２）关闭电源，取出凝胶，放入凝胶成像仪观察。 　 离心技术 （高速冷冻离心机） 离心机工作规则： 1、检查离心管是否完好，不要使用有裂缝的离心管。即使极小的裂缝也会在离心力作用下破裂。 2、每次使用前都要检查转子中是否有别人遗留的离心管。转子中遗留的离心管可能导致离心机不平衡。 3、将平衡的离心管对位放置，盖好转子盖。如果离心启动后发现转子盖没盖，应停止离心，盖上转子盖后再启动。 4、离心完成后应立即从离心机内取走样品。离心结束后若样品长时间留在离心机里。会沉淀重新分散开。 5.低温离心机在两次运行之间应关上盖子，以避免冷凝。 6.每一次使用完离心机后都要将离心机内部清理干净并填写使用记录。 微量移液技术 量液操作注意问题： （1）不能移取量程以外体积的液体，否则会损坏移液器。 （2）吸取液体时，先推至第一档在吸取；释放液体时，在第一档停顿1-2s后推至终点。 （3）吸取液体时不能太快。如果不小心将液体吸入吸液杆应报告指导老师，经清洗后方可再用。 （4）使用完后，一定要将移液量调至最大量程，以免压缩弹簧导致弹簧不能回复。 （5）移液器必须卸掉枪头后才能放在移液器架上。 各种酶等溶液的移取问题 分子生物学中由于移取试剂体积较小可以使用微量移液器先将试剂（如引物,缓冲液等）分别加到管壁上，加完之后通过点动离心,使液体聚到管底，然后轻弹管底使之充分混匀。 分子生物学反应体系中的酶要最后加入到体系中. 无菌操作技术 器材包扎 1、三角瓶至少留1/3空间，先盖透气膜，后盖报纸，线绳缠好。 培养时不能覆盖报纸，透气膜用完后回收。 2、枪头盒、EP管盒、培养皿要用报纸包好。 3、离心筒将盖旋紧后回旋半圈，报纸包扎。 灭菌 确认高压灭菌锅在打开前，其中的压力已经回复到和周围环境的压力一致，打开的时候要缓慢，避免与溢出的蒸汽接触。 包扎物品（每2人） 1、枪头盒 3个/套 2、EP管盒 1个 装两排EP管，EP管不扣盖 3、培养皿 5个/包 4