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分析真核表达质粒转染牙髓干细胞的研究 　　基因工程重组技术是生物工程的一个重要分支，可以将目的基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个目的基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，其中将目的基因转移至受体细胞的能自我复制的载体影响着基因工程的研究进程。pCDNA3.1+是一种真核表达载体，在哺乳动物表达载体能使重组质粒获得高水平表达的重组蛋白，目前用pCDNA3.1结合各种基因构建质粒转染神经干细胞、骨髓基质干细胞和软骨细胞的研究都取得成功，对各种干细胞的增值和分化都取得较好的作用。本次实验用成功构建的pCDNA3.1-HEGF真核表达质粒转染牙髓干细胞，并通过Q-PCR和Western　blot检测hEGF基因及蛋白的表达，为下一步的牙髓干细胞的增殖和分化取得前期的实验基础。 　　1材料和方法 　　1.1主要试剂与主要仪器 　　倒置显微镜(OLYMPUS，日本)、细胞培养箱(Shellab，美国)、生物安全柜(上海博讯实业有限公司)、微量移液器(Eppendorf，德国)、荧光定量PCR(FTC2000，Canada)、超净工作台(VS-1300，中国苏州)、迷你型超速离心机(Eppendorf，德国)、Trans-BlotSD　Cell半干转仪(Bio-Rad，美国)、TC2323二氧化碳培养箱(Sheldon　Manufacturing，美国)、图像分析系统(LabworksTM　Analysis　Softwar，美国)、MEM 培养基(GIBCO，美国)、胎牛血清(GIBCO，美国)、胰蛋白酶、青霉素、链霉素(Sigma，美国)、DMSO (Amresco，公司)、Translipid(汉恒，中国)、小提试剂盒、大提试剂盒(OMEGA，美国)、HRP二抗(GenScript，美国)、内参一抗(GenScript，美国)、ECL化学发光试剂(PERCIE，美国)一抗：(RD，美国)，pCDNA3.1-HEGF真核表达质粒(保存于井冈山大学医学院中心实验室)。 　　1.2实验方法 　　1.2.1细胞准备牙髓干细胞在37℃，相对湿度100%，5%CO2培养箱中，然后置于含10%FBS，100kU/L 青霉素，100mg/L链霉素的MEM 培养基的条件下培养;每3-4d换液一次，0.25%胰蛋白酶每5-6d消化传代一次。在显微镜下观察培养瓶贴壁面至70%-80%融合，在超净工作台上操作，先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2-3次，50ml培养瓶加入胰酶消化液约1-3ml，按此比例进行消化，晃动使消化液铺均匀，置37℃培养箱约2-5min，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液，按照1∶2或1∶3的比例传代至无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。 　　1.2.2质粒小提和大提实验中质粒小提是在10-20ml试管中，将携带有所需质粒的E.coli接种到5ml　LB培养基LB(含氨苄青霉素50mu;g/ml)，37℃振荡培养12-16h。试验中质粒大提是将带有目的质粒的大肠杆菌接种到200-500ml　LB(含氨苄青霉素50mu;g/ml)，1-4L培养瓶中37℃震荡培养过夜(12-16h)，然后按照试剂盒的说明书进行质粒小提和大提。 　　1.2.3hEGF质粒转染牙髓干细胞实验分为5组，H-KB表示正常细胞，H-0表示转染空载体的细胞，H-1、H-2、H-3表示转染目标质粒的细胞。用24孔板，每孔细胞接种0.5-2times;107个细胞，使转染时细胞达到70%左右的回合率，细胞培养24h后，更换新的培养基。将0.8mu;g质粒稀释于50mu;l　MEM 培养基，轻轻混匀，并将2mu;lTransLipid稀释于48mu;l　MEM 培养基，轻轻混匀，室温孵育5min。然后两种液体轻轻混匀，室温孵育20 min，使DNA-TransLipid 复合物形成。将100mu;l　DNA-TransLipid复合物加入培养板中，轻轻摇匀，将培养板放入37℃培养箱中，转染4-6h后更换新的培养基，继续培养18-72h。 　　1.2.4转染牙髓干细胞的筛选弃去原MEM 培养液，用浓度400nmol/L作为G418的筛选浓度，转染细胞传代后换含400nmol/L　G418的牙髓干细胞MEM 培养液培养、筛选，定期更换培养液，培养2w后收集G418抗性细胞克隆，将其挑至24孔板，并在MEM 培养液中继续培养2w。 　　1.2.5Q-PCR检测hEGF基因在NCBI的Genbank中查找出人HEGF基因的DNA序列，设计引物hEGFF(TGAGAGTAA