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关于β-内酰胺抗生素的原核表达、纯化及鉴定 　　beta;-内酰胺类抗生素(beta;-lactam antibiotics) 由于抗菌作用强，毒性低是目前临床抗感染治疗最普遍的一类抗生素。beta;-内酰胺类抗生素可以不可逆地结合到青霉素结合蛋白(PBPs的活性部位，而使其失活。由于PBPs 是一组细菌细胞壁合成的关键酶，抑制其活性就会然阻断细菌细胞壁的合成，导致细菌渗透裂解然后死亡。beta;-内酰胺类抗生素的优势是它可以选择性的作用于快速分裂的细菌，而作为宿主的人类细胞因为没有细胞壁就会不受影响。随着抗生素的广泛使用(尤其是吴用和滥用)以及致病菌的进化，使得耐药性传染病菌不断涌现和全球蔓延，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。最近，数株肺炎克雷伯菌更被确定为具有超广谱抗性，几乎可以抵抗所有的beta;-内酰胺类抗生素，甚至包括“最后的”防线碳青霉烯类抗生素。这些所谓“超级病菌”的耐药菌株，由于治疗难度很高，导致住院时间延长并增加感染的广泛传播的机会，从而给医疗保健系统带来巨大的风险。细菌可以通过多种方式获得对beta;-内酰胺抗生素抗药性，包括突变青霉素结合蛋白(PBP)的活性位点，使beta;-内酰胺不能结合到它的作用靶点;或者是增加外排，泵出侵入细菌的抗生素;又或是表达beta;-内酰胺酶来使抗生素失活。其中，beta;-内酰胺酶的产生是最重要的，也是最多被研究细菌耐药性的机制。beta;-内酰胺酶可以通过细菌染色体嵌入基因或者是通过水平基因转移而获得，这些酶可以水解抗生素独特的beta;-内酰胺环，使他们不能有效结合到PBPs 而失去活性。研究表明，虽然beta;-内酰胺酶的总数高得惊人并在不断增长，但是这些酶的许多成员之间可能只有很小的差别，只有一个或几个热点氨基酸残基发生了突变，从而导致beta;-内酰胺酶活性中心的构象发生改变，继而其作用底物谱也发生改变。penP，TEM-1 和SHV-1 系列是A 类beta;-内酰胺酶的典型代表，其与90%革兰阴性菌对青霉素耐药性相关。penP，其与TEM-1 和SHV-1 的序列相似性高，热稳定性高(Tm ～65 ℃) ，使得它可以广泛用于突变与酶结构，酶活性关系方面的研究。氨基酸残基E166 是beta;-内酰胺酶penP 的关键活性位点，其作为一般碱，与酶的水解活性密切相关。本研究拟构建penP-E166C 的突变质粒并纯化突变体蛋白，为今后的结构生物学实验提供蛋白来源。结构生物学实验将会进一步弄清影响beta;-内酰胺酶活性的关键氨基酸残基提供实验基础，为将来设计beta;-内酰胺酶抑制剂，逆转抗生素广谱耐药性提供重要的理论依据。 　　1 材料与方法 　　1. 1 菌株与质粒 　　感受态大肠杆菌DH5alpha; 和BL21DE3 购买自Invitrogen，包含Penp 全长序列的质粒pRset-K_6xHis_TEV_PenP 由本科室保存。 　　1. 2 主要仪器与试剂 　　梯度PCR 仪( 美国Bio-Rad 公司)，琼脂糖水平电泳仪( 北京市六一仪器厂)，凝胶扫描成像系统( 美国Bio-Rad 公__司)，蛋白质垂直电泳槽( 美国Bio-Rad 公司) ，台式高速冷冻离心机( 德国Eppendorf 公司)，His-trap HP 型镍离子亲和层析柱( 美国GE 公司)，HiLoad 16 /60，superdex 75 凝胶过滤色谱柱(美国GE 公司)，AKTA 快速蛋白纯化色谱仪( 美国GE 公司)。Phu DNA 聚合酶，BamHI，EcoRI 限制性内切酶、T4 DNA连接酶均为Fermentas 产品、、琼脂糖凝胶DNA 回收，质粒提取试剂盒购自上海桑尼生物科技有限公司产品。引物合成、质粒测序均委托北京六合华大基因科技有限公司完成。 　　1. 3 PCR 介导的Penp 基因 　　体外定点突变以pRset-K_6xHis_TEV_PenP 为模板和table1 中所列的引物，Quick Change Site-Directed Mutagenesis 试剂盒( Strategene)进行PCR 介导的体外定点突变。PCR 组分和反应程序见table2 和table3. PCR 结束后加入1mu;L DpnⅠ酶消化原始模板。将消化后产物直接转化大肠杆菌感受态细胞E. coliDH5alpha;，以含50 mu;g /mL 卡那霉素的LB 平板筛选阳性克隆，突变子最终通过测序确定。 　　1. 4 重组蛋白质的诱导表达 　　将测序鉴定正确的突变型pRset-K_6xHis_TEV_PenP_E166C 质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21DE3，37℃过夜培养后挑取单菌