大肠埃希菌生物膜在三种导尿材料上形成的对比方.docVIP

大肠埃希菌生物膜在三种导尿材料上形成的对比方 　　【摘要】 目的：观察不同材质导尿管对大肠埃希菌生物膜形成的影响。方法：在乳胶、纯硅胶、硅橡胶材质导尿管膜片上制备大肠埃希菌生物膜，扫描电镜观察生物膜的形态。用冲洗、冲洗+超声振荡方法处理附有不同生长时期生物膜的导尿管，通过菌落计数法了解两种方法对不同时期生物膜的清除效应。结果：乳胶、纯硅胶、硅橡胶导尿管生物膜内均有细菌团块样聚集，可见纤维素样物质交联。硅橡胶导尿管生物膜内纤维素样交联物相对较少。在生物膜形成的初期，两种处理方法具有相同清除效应；但当生物膜趋于成熟后，单用冲洗方法难以将黏附细菌洗脱。结论：建议选择使用经济、实用的硅橡胶导尿管。在生物膜形成初期，对导尿管一般冲洗能较彻底地清除黏附细菌。 　　【关键词】 导尿管； 大肠埃希菌； 生物膜； 扫描电镜 　　留置导尿是临床常用的一种操作技术，导尿管伴随尿道感染（Catheter-associated urinary tract infection，CAUTI）是留置导尿引起的一种常见的医院感染。尽管采取无菌操作等措施，仍然有1/3导尿管伴随尿路感染无法控制。导尿管的生物材料等因素与泌尿系统感染有直接关系。笔者对比不同材质导尿管生物膜形成的过程，为临床合理选择导尿管提供客观依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 导尿管种类 纯硅胶导尿管（广州市香雪生物医学工程有限公司）、乳胶导尿管（广州市韦士泰医疗器械有限公司）、硅橡胶导尿管（秦皇岛市旭明医用硅橡胶制品有限公司）。 　　1.2 标准菌株 大肠埃希菌菌株：沈阳医学院病原生物学教研室提供（经ATB生化鉴定）。 　　1.3 生物膜的制备 将三种材料的导尿管用打孔器制备成直径为0.7 cm圆片，高压蒸汽灭菌后分别放入含有2 mL/孔MH肉汤的12孔培养板，每孔加入0.5比浊的大肠埃希菌菌液50 ?L，置于37 ℃生化培养箱中培养，每24小时更换培养液一次，共培养3 d。 　　1.4 扫描电镜观察 取出培养18、24、48、72 h导尿管膜片，用无菌生理盐水冲洗，洗掉浮游细菌，至2.5%戊二醛溶液中4 ℃固定2 h，以pH 7.2的磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，再以1%锇酸4 ℃固定2 h，4 ℃磷酸缓冲液冲洗3次，20 min/次，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过SEM进行观察。 　　1.5 处理生物膜 分别在孵育18、24、48、72 h各取出6块膜片，分成两组，每组3片，分别用以下两种方法处理：（1）用0.9%NS 2mL冲洗5次，收集洗脱液于20 mL无菌离心管里。（2）用0.9%NS 2 mL冲洗4次，置于含2 mL 0.9%NS的无菌试管中，超声震荡120 W，15 min，收集所有洗脱液（6 mL）于20 mL无菌离心管里。将以上两种方法所得洗脱液吸取0.1 mL，倍比稀释至10万倍，取出0.1 mL稀释液注入无菌平皿中，加入高压蒸汽灭菌后冷却至40 ℃左右的营养琼脂中混匀，置于37 ℃生化培养箱，孵育24 h，用全自动菌落分析仪（杭州迅数科技有限公司，型号HR2）计数细菌培养基上菌落数量。上述实验重复进行三次。 　　1.6 菌落计数的换算 按以下公式算出实际菌落数。实际菌落数（CFU/cm3）=肉眼可计菌落数×稀释倍数/膜片体积，取实际菌落数的常用对数（lgCFU/cm3）为标准菌落计数单位。 　　1.7 统计学处理 菌落计数换算为标准菌落计数单位，采用SAS 8.1软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验或方差分析，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 扫描电镜观察 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），无明显细菌生物膜形成。培养48 h后，细菌生物膜形成。硅橡胶导尿管表面细菌生物膜形成较晚且生物膜内细菌数量相对较少，见图1。 　　2.2 菌落计数比较 大肠埃希菌在纯硅胶、乳胶、硅橡胶三种材质表面孵育早期（18～24 h），冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异无统计学意义（P0.05），且经过冲洗+振荡处理后三种材质间的对数菌落计算的比较差异也均无统计学意义（F=0.03，P=0.9584；F=3.56，P=0.0923）。而在生物膜形成的后期48 h和72 h时，冲洗和冲洗+振荡两种处理方法的生物膜内细菌的菌落计数比较差异均有统计学意义（P0.05），三种材质间的对数菌落计算的比较差异均有统计学意义（F=16.77，P=0.0015；F=89.21，P=0.0001），见表1。 　　3 讨论 　　细菌生物膜（bacteria biofilm，BBF）是附着于惰性或者活性实体表面的