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基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值 　　[摘要] 目的 探讨基因芯片技术检测结核分枝杆菌耐药性的临床价值。方法 回顾性分析685例结核病临床疑似病例的临床资料，采用晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术进行检测。 结果 本组685例临床疑似病例中，阳性135例，阳性率为19.7%，基因芯片检测结果显示结核131例，非结核4例，阳性率为19.1%。耐药基因检测68例，利福平和异烟肼基因突变12例，总突变率为17.6%，其中11例为利福平和异烟肼均耐药，双重基因突变率为16.2%，另1例只耐利福平。利福平总突变率为17.6%，异烟肼总突变率为16.2%，耐多药率为16.2%。 结论 晶芯结核分枝杆菌生物芯片技术用于临床诊断结核病及其耐药性，能够缩短诊断时间，提高临床时效性，值得推广应用。 　　[关键词] 结核分枝杆菌；基因芯片；结核病诊断 　　[中图分类号] R378.91+1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2014）01（b）-0123-03 　　国内每年有将近13万人因结核病死亡[1]，且有将近12万新发耐多药结核病患者，未来数年内可能出现耐药菌为主的流行态势[2]。目前，结核病诊断的标准方法主要包括分枝杆菌分离培养、抗酸菌痰涂片镜检、菌种鉴定和药敏试验等，但是其普遍存在特异性差、灵敏度低或需时长的缺点[3]，本院引进国内必威体育精装版的结核诊断技术——晶芯结核分枝杆菌生物芯片诊断系统，是近年发展起来的进行大规模遗传多态性检测的新方法[4]，其应用于临床诊断结核病，提高了时效性，现报道如下。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　本院2013年3月1日～2013年9月30日接受诊治的结核病临床疑似病例共685例，其中男性363例，女性322例；年龄9～76岁，平均（34.51±2.28）岁；其中临床诊断结核病病例681例，包括185例痰结核菌培养阴性肺结核，157例痰结核菌培养阳性肺结核，193例结核性脑膜炎，95例结核性胸膜炎，51例骨结核。非结核分枝杆菌病4例。 　　1.2 试剂与仪器 　　Extractor 36核酸提取仪、BioMixerⅡ芯片杂交仪、Slider Washer芯片洗干仪、LuxScan 10 K-B芯片扫描仪、晶芯分枝杆菌菌种鉴定试剂盒、晶芯结核分枝杆菌耐药基因检测试剂盒，均购自博奥生物有限公司。 　　1.3 方法 　　1.3.1 标本的处理 以痰样本为例（其余样本同痰样本处理方法）：①向痰液中加入等体积10%NaOH，涡旋振荡，充分液化均匀，也可37℃液化30 min后再振荡；②取1 ml液化后的痰液转入1.5 ml Eppendorf管中，12 000 r/min，5 min，弃去上清；③加入1 ml生理盐水，涡旋振荡后12 000 r/min，5 min，弃去上清。 　　1.3.2 核酸提取 ①向处理好的标本管内加入80 μl核酸提取液，用加样器混匀后转入核酸提取管内；②用核酸快速提取仪振荡10 min，然后95℃水浴5 min。 　　1.3.3 PCR扩增 ①从B试剂盒取出PCR扩增试剂，自然解冻后轻摇，迅速离心后分装18 μl至八联排管中，加上盖，标上编号；②加入2 μl样本核酸溶液，用加样器吸打混匀；③上机扩增。 　　1.3.4 芯片杂交 ①将PCR产物置PCR仪扩增95℃变性5 min，随后立即放入冰水混合物中，骤冷冰浴3 min；②取9 μl杂交缓冲液至八联排管中，再按样品顺序加6 μl PCR产物；③准备杂交盒，将14 μl杂交混合物加入芯片点阵中，完成后且金属封条密封杂交盒；④放入杂交仪内50℃杂交2 h；⑤将芯片洗干，甩水。 　　1.3.5 芯片扫描结果判读 开启扫描仪，预热激光10 min，输入芯片编号，样本信息，选择样本，开始扫描，并判读结果。 　　2 结果 　　2.1 结核分枝杆菌基因芯片检测对结核病的诊断结果 　　本组结核菌基因检测685例临床疑似病例中，阳性患者135例，阳性率为19.7%，通过基因芯片检测结果显示，结核患者131例，非结核患者4例，阳性率为19.1%。 　　2.2 结核分枝杆菌基因芯片法耐药基因变异的检测结果 　　随机选取68例阳性患者进行耐药基因检测，通过基因芯片检测结果显示，12例患者发生基因突变，总突变率为17.6%；其中11例患者为利福平和异烟肼双重基因突变，双重基因突变率为16.2%，另1例只发生利福平基因突变；耐多药率为16.2%。利福平总突变率为17.6%，其中9例为531（C-T）位点突变，3例为526（C-T）位点突变；异烟肼总突变率为16.2%，其中7例患者为katG 315（G-C）位点突变，3例为inhA-15（C-T）位点突变，1例为katG 315（G-A