不同纯度高良姜素对A375—HaCaT共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响.docVIP

不同纯度高良姜素对A375—HaCaT共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响 　　摘要：目的 研究不同纯度高良姜素对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养模型中黑素细胞增殖及黑素合成的影响。方法 利用Transwell技术建立A375-HaCaT共培养体系，以0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素作用于共培养模型。采用MTT比色法检测细胞增殖，NaOH裂解法测定黑素含量，多巴氧化法测定酪氨酸酶活性，ELISA法检测HaCaT细胞因子干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1的表达。结果 A375-HaCaT共培养模型中的A375细胞生长良好，0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL纯度为70%和90%的高良姜素对共培养体系中的A375细胞增殖、酪氨酸酶活性及黑素合成均具有上调作用。各纯度高良姜素浓度≥0.5 μg/mL时，能够提高HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平，且纯度70%的高良姜素作用强度优于90%的高良姜素。结论 高良姜素能显著促进A375-HaCaT共培养模型中A375的细胞增殖及黑素合成，其作用机制可能与高良姜素上调HaCaT细胞中的ET-1和SCF等细胞因子的表达水平有关。 　　关键词：高良姜素；黑色素瘤细胞；角质形成细胞；共培养模型；细胞增殖；黑素；内皮素 　　白癜风是一种色素障碍性疾病，表现为皮肤脱色而影响美容。由于该病多发于皮肤暴露部位，常给患者带来巨大的心理压力，故一直是皮肤科领域的研究热点。维吾尔医在治疗白癜风方面拥有丰富的诊疗经验。高良姜是维医治疗白癜风常用药驱白巴布期片中的一味主药，以往药理学研究表明，该药具有胃肠道调节作用、平滑肌解痉挛作用、免疫调节作用、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗癌等多种药理活性[1]。近年来，本课题组通过体内外药效筛选模型确定高良姜总黄酮对白癜风具有良好治疗作用[2]。目前，关于高良姜黄酮类成分高良姜素（Galangin，GL）对人黑色素瘤细胞-人永生化角质形成细胞（A375-HaCaT）共培养体系的作用研究未见报道。因此，本研究拟通过Transwell小室建立A375-HaCaT共培养模型，研究不同纯度、不同浓度的GL对共培养模型中的A375细胞增殖及黑素合成的影响，为高良姜治疗白癜风的新药研制及临床合理用药提供实验依据。 　　1 实验材料 　　1.1 药物 　　GL由新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所基础医学研究室从植物高良姜中分离纯化，化学结构经核磁共振波谱法和质谱法确认，高效液相色谱面积归一化法鉴定其纯度为70%和90%。 　　1.2 细胞株 　　人黑色素瘤细胞株A375细胞购自中国科学院细胞库，人永生化角质形成细胞株HaCaT购自中国典型培养物保藏中心。 　　1.3 主要试剂 　　氨苄青霉素钠和硫酸链霉素（Amersco产品）， DMEM高糖培养基（GIBCO产品），胎牛血清（Hyclone产品），二甲基亚砜（DMSO）、Triton-X100、L-Dopa、MTT、胰蛋白酶（Sigma产品），干细胞生长因子（SCF）、内皮素（ET）-1试剂盒（南京建成生物工程研究所产品）。 　　1.4 主要仪器 　　YJ-875超净工作台（江苏苏净集团），37XB倒置显微镜（上海光学六厂），MCO-18AIC CO2培养箱（Sanyo）， Multiskan Go 1510酶标仪（Thermo Fisher）。 　　2 实验方法 　　2.1 A375-HaCaT细胞共培养体系的建立与细胞给药 　　将处于对数生长期的A375细胞以0.25%胰酶消化，DMEM培养基稀释细胞浓度至5×104个/mL，均匀铺于24孔板。然后将Transwell小室（孔径3 μm，直径12 mm）置于24孔板中，使小室的底部能够接触到黑素细胞培养基。胰酶消化HaCaT细胞，亦用DMEM培养基稀释HaCaT浓度至1.5×105个/mL，转入Transwell小室孔中，每孔1 mL，共培养48 h后，分组给药。分别设定空白对照组、阳性药甲氧沙林（8-MOP）组、70%GL组、90%GL组。其中，空白组加入不含血清的DMEM培养基，其余各组均加入无血清药液，配制浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10 μg/mL。各给药组作用24 h后，于显微镜下观察细胞形态并拍照。 　　2.2 A375细胞增殖检测 　　细胞接种于24孔培养板培养48 h，经上述方法处理后加入MTT，继续培养4 h，吸弃培养液，加入DMSO震荡溶解后，于酶标仪测定490 nm处吸光度值。 　　2.3 A375细胞黑素含量检测 　　A375-HaCaT细胞共培养48 h后，经药物作用后，移去Transwe