h5n1亚型禽感病毒ha1基因的克隆与原核表达.pdf

中文摘要 Avian Influenza，HPAI)是严重危害畜牧 高致病性禽流感(HighlyPathogenic 业和人类健康的一种传染性疾病。近年来，安徽省多次发生H5NI亚型高致病性 禽流感疫情，给我省养禽业构成极大危胁。因此，寻找一种理想的免疫保护性抗 原用于该病的快速诊断与免疫防治以及加强高致病性禽流感分子流行病学的研 究具有重要实际意义。 对细胞吸附与膜融合过程中起关键作用的糖蛋白。AIV感染细胞后HA蛋白即被 水解为HAl和HA2两部分。其中HAl蛋白具有与宿主细胞表面受体发生特异性结 合的特性，也是HA蛋白的主要保护性抗原成分，研究HAl蛋白对揭示禽流感病 毒的致病机理，研制以抗吸附作用为主的HAl疫苗具有重要的指导意义。本课题 pGEX．4T．1．HAl两种重组质粒并进行原核表达。旨在从分子水平揭示安徽分离 株与国内外其它分离株间的同源性，探讨HAl蛋白结构特征，表达获得大量重组 ttAl蛋白，为下一步制备HAl单克隆抗体、研究其功能提供物质基础，也为进一 步研制HAl基因工程疫苗奠定基础。 首先，采用RT-PCR方法扩增HAl基因片段，对该片段进行克隆测序和生物 信息学分析。研究中我们首先根据Genbank中登录的H5N1亚型AIVHAl基因序 列，设计合成一对针对HAl基因的特异性引物，以灭活的病鸡脑组织提取RNA， 克隆质粒pMDl8-T-HAl，提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后，筛选阳性重组 038 克隆进行序列测定。结果显示该安徽分离株的HAl基因片段长1bp，编码346 个氨基酸，其N端前16个氨基酸组成信号肽，在HA切割位点处有6个碱性氨基酸 序列(RRRKKR)，表明该分离株为强毒株。将该安徽分离株HAt基因片段测序 结果与基因库中登录的21个同一亚型禽流感病毒国内外分离株相应基因片段进 行了核苷酸和推导氨基酸序列比较分析，发现该安徽分离株与其他国内外分离株 间的核苷酸和氨基酸同源性均较高，分别介于96．3％～97．4％和97．0％～97．9％之 间，尤其与河南分离株(AY741217)亲缘关系最大，提示这两个毒株可能具有相同 的祖先。 其次，选择不同的生物学分析软件或网络服务器，对HAl基因片段编码的氨 基酸序列基本特征、蛋白的跨膜区、疏水性、信号肽、蛋白位点、抗原位点和二 级结构等进行预测和分析。结果显示该蛋白由346个氨基酸组成，分子量为 酸143个，占41，33％。蛋白N末端的5～15aa之间含有～个跨膜区，N末端含有一 个明显的疏水区，蛋白结构中含有6个N．糖基化位点，5个蛋白激酶C磷酸化位点， 3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和4个肉豆蔻基位点。该蛋白的二级结构主要以证一 237aa一242aa、291aa．296aa、336aa．344aa之间可能存在抗原表位。 研究中根据测得的HAl基因序列、HAl基因编码区蛋白的结构特征以及pET-32a 与pGEX一4T-1融合表达载体阅读框的要求，重新设计一对引物，扩增除去信号 肽序列的HAl基因片段。将扩增后的HAl基因片断经BamHI和Sa／I双酶切 后，分别插入经同样双酶切的融合表达载体pET-32a与pGEX-4T-1中，构建重 至E,coli BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达、产物鉴定、产物定位和可溶性分 小时后，Trx．HAl融合蛋白表达量达到高峰(占细菌总蛋白的44．1％)；Trx．HAl 融合蛋白主要是以包涵体形式表达，少量以可溶性形式表达； 量达到高峰(占细菌总蛋白的33．2％)，GST-HAl融合蛋白完全以包涵体形式表 达。Western—Blot免疫印迹分析表明两种融合蛋白均能与H5亚型HI阳性血清发 生特异性反应，重组蛋白HAl(rHAl)具有良好的抗原性。 综上所述，本研究通过对HAl基因克隆测序和生物信息学分析，从分子水平 揭示了H5NI亚型禽流感病毒安徽分离株与国内外其它分离株间具有高度同源 性，探讨了HAl基因片段编码区蛋白的结构特征。同时，本研究中成功构建了 GST基因共表达方式获得了大量rHAI蛋白，为进一步制备HAl单克隆抗体、研 究其生物学功能提供了物质基础，也为迸一步研制HAl基因工程疫苗奠定了基 础。 关键词：禽流感病毒，血凝素基因，基因克隆，生物信息学分析，原核表达