h5n2亚型av ha基因真核表达载体的构建、表达及免疫试验.pdf

l V H5N2亚型AHA基因真核表达载体的构建、表达及免疫试验 摘 要 禽流感(AI)是由A型流感病毒引起的禽类毁灭性疾病。高致病性禽流感被国际 兽医局(OIE)定为A类传染病。该病自1878年首次报道以来，世界上许多国家和 地区均有发生，AI不仅给世界养禽业造成了巨大的经济损失，而且对人类健康和生 更加关注禽流感的公共卫生意义。 AIV呈球型，有囊膜。其表面有2种糖蛋白，其中之一是血凝素(HA)蛋白， 主要作用是结合宿主唾液酸之类受体，能诱导产生中和抗体，是AIV的主要保护性 抗原。 本研究对禽流感分离株H5N2的血凝素(HA)基因进行扩增、克隆、序列测定及 fibroblast 比较分析；同时构建了真核表达质粒pVAXI．HA，并在Cllickenembryo (CEF)细胞中进行了表达；用重组质粒进行了动物保护性试验。为禽流感的防治提 供科学的试验数据。 异性引物，运用反转录一聚合酶链反应(RT-PCR)技术从H5N2亚型禽流感病毒分离 株的尿囊液中扩增HA基因的eDNA，将其克隆到pMDl8W载体，转化到感受态大 克隆重组质粒pMDl8．T-HA进行核苷酸序列的测定、同源性比较、HA基因系统发育 进化树分析和氨基酸编码分析。结果表明，克隆到的HA基因全长1695bp，包括全部 开放阅读框架，编码564个氨基酸。分离株与H5N1亚型禽流感病毒的HA基因同源性 较高，在94％以上。推导氨基酸的序列分析表明，其HA蛋白裂解位点仅包含1个碱 性氨基酸残基，符合低致病力MV的基因特征。 将克隆质粒pMDl8-％HA中的HA基因序列亚克隆至真核表达载体pVAXl中。 重组质粒pVAXI—HA，以质脂体介导法将其转染至CEF单层细胞中，通过荧光抗体 技术和RT—PER技术证实目的基因在动物细胞中获得了表达。此后进行了动物保护性 p 试验，以50g重组质粒对3周龄SPF雏鸡进行免疫，同时设置生理盐水和灭活疫苗 对照组，加强免疫一次后进行病毒攻击，结果鸡群获得了90％的保护率。 关键词；禽流感，血凝素蛋白，克隆，序列，表达，免疫 TestofAvian andImmuneProtection Construction、Expression HAGene Vectors InfluenzaVirusH5N2 Eukaryotic Abstract Avian anumberofinfluenzaAvirusandcancausefataldiseaseforavian influenza(AI)is specises． HPAIVwas theclassAinfectiousdisease was in1878andhas placed byOIE．Since，Itreported allovertheworld．1thasnot ledtothe loss ofthe poultry beeninghappened only seriouslyofeconomy the alsothreatedhumanhealth Influenza allover enterprise world，but seriously．Avian and in in