PCBP1 RNAi重组慢病毒包装及筛选其稳定感染的神经细胞系.pdfVIP

· 论 善 · JMedRes，Feb2012，Vo1．41No．2 PCBP1RNAi重组慢病毒包装及筛选其 稳定感染的神经细胞系 王兰英 霍丽蓉 摘 要 目的 PCBP1是真核细胞 内的一种桥梁蛋 白，具有多种生物学功能。本研究以慢病毒质粒构建PCBP1基因小干 扰 RNA(smallinterferingRNA，siRNA)表达载体 ，并筛选其稳定感染的神经细胞系，为进一步通过该载体系统探讨 PCBP1的具体 功能提供有力手段。方法 设计合成针对人及小鼠的PCBP1基因的 siRNA茎环结构的正反义序列 ，退火形成双链 ，与pLenti． Lox3．7载体的双酶切产物连接 ，以质粒PCR、酶切和DNA测序等方法，对重组克隆进行鉴定以确认 目的片段的插入。之后，采用 脂质体转染，将慢病毒载体系统的核心载体 pLentiLox3．7和包装质粒共转染 293T细胞，收获病毒颗粒，分别感染 SH—SY5Y细 胞 ，再通过流式分选获得感染不同病毒颗粒的细胞 ，提取 RNA检测 PCBP1mRNA水平 。结果 检测结果显示 PCBP1siRNA茎环 结构序列正确插入 pLentiLox3．7载体 ，并且成功构建 PCBP1基 因敲低 的神经细胞系。结论 PCBP1基因 siRNA表达载体及其基 因敲低稳定细胞系的成功构建，为进一步研究该基 因在相应细胞 中的功能奠定了基础 。 关键词 PCBP1 RNA干扰 慢病毒载体 神经细胞 PackagingPCBP1RNAi—lentivirusandScreeningtheInfectedSH —SY5Y Cells． WangLanying．HuoLirong．ShanxiMedicalUniversi— ty，Shanxi030001，China Abstract 0bjective PCBP1posesmultiplefunctionsanditisanimportantmemberineukaryocytes．Tofurtherdeterminetheim— portantfunctionofPCBP1inneurocytes．weconstructedtherecombinatedRNAi—lentivirusandinfectedSH—SY5Y cellswiththecorre— spondingvirussupernatant．M ethods FourpairssiRNAsofPCBP1weredevised，synthesizedandannealedtogeneratedoublestrands． AndthenthefourkindsofdoublestrandswereconnectedwithpLentiLox3．7toform recombinatedplasmids．AfteridentifiedwithPCR，en— zymicmethodandsequencing，transfaeting4kindsofpackagingplasmidsinto293T cellswasusedtoproducingvirussupernatant．Then SH —SY5Y cellswereinfectedwithdifferentvirussupernatantandtheinfectedcellsweresortingwithasepticflow eytometry．Atlast，total RNAswereextractedtodetectedPCBP1mRNA levelswithreal—timePCR．Results PCBP1shRNAswerecorrectly insertedpLL3．7 palsmid，andPCBP1knocked—downneurocytesweresuccessfullyconstructed．Conclusion PCBP1siRNA reeombinatedplasmidand SH —SY5Y cellswithPCBP1knocked—downprovidedaplatform tostudythisgenefunctioninneurocytes． Keywords PCBP1；RNA interference；Lentivirus；Neurocyte HnRNPs(