新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析.pdfVIP

维普资讯 动物医学进展 ，2007，28(1O)：1-7 ProgressinVeterinaryM edicine 新城疫病毒 ShD一5—04株 F基 因的克隆与毒力分析 刘 栋 ，朱剑英 ，牛钟相 ，王希军 (1．山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018；2．济南市畜牧办公室。山东济南 250002) 摘 要 ：通过 RT-PCR特并性扩增 出新城疫病毒 (NDV)山东分离株 (ShD-5—04)的F基 因序列，对其进 行核苷酸序列测定和分析。结果表明，ShD-5—04株的F基因开放性阅读框为 1662bp，编码489个氨基酸。 与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相 同序列进行 比较，F基 因核苷酸序列的同源性在 84．1 ～88．7 之间，氨基酸 同源性在 88．1％～93．3 之间；F蛋白裂解位点区(112位～l17位)氨基酸组 成与强毒株一致 ，从基 因水平上说 明NDVShD-5—04株为新城疫强毒株。 关键词 ：新城疫病毒；分子生物学；非典型新城疫；鸡 中图分类号：$852．659．5I$858．31 文献标识码：A 文章编号：1007—5038(2007)10—0001—07 新城疫 (Newcastledisease，ND)是由新城疫病 公司。 毒 (Newcastlediseasevirus，NDV)引起 的严重危害 1．2 主要酶和试剂 养禽业的传染病 。在我 国，随着大规模 的疫苗预防 各种 限制 性 内切酶、T4DNA 连接酶、Taq 接种及隔离消毒等措施 的实施 ，使该病造成的损失 DNA聚合酶、禽源反转录酶 (AMV)、RNA酶抑制 大幅度减少 。但近几年 ND的流行又有 了新 的特 剂、dNTP、IPTG、X—gal等均购 自宝生物工程(大连) 点，其主要特点是不表现特异性症状的ND病例 日 有限公司或Promega公司；琼脂糖、EcoRI、DNA 益增多，甚至高抗体鸡群也发病 ，给该病 的预防带来 Marker111和 250bpDNAMarkerplus购 自上海生 了很多困难。F蛋 白是NDV的重要功能性糖蛋白， 工生物工程技术服务有限公司；DNA快速 回收试剂 其结构功能的变化与NDV致病性密切相关，所 以 盒和质粒微量快速提取试剂盒均购 自宝生物工程 有关NDV的研究集中于F蛋 白的研究。 (大连)有限公司；其余试剂均为进 口或国产分析纯 2004年从山东潍坊不表现典型 ND症状的高 试剂 。 抗体水平(抗体效价 2。)蛋鸡群 中分离到一株疑似变 1．3 NDV 的纯化 、增殖、浓缩及总RNA 的提取 异NDV，暂命名为NDV ShD-5-04株，通过对其生 分离种毒经鸡成纤维细胞 (CEF)蚀斑纯化 3 物学研究表明，该病毒具有新城疫强毒株 的一些特 代。将纯化后种毒 1：1000倍稀释，接种于 9日龄 征L1]。本研究进一步从基 因和分子水平上证实 了 SPF鸡胚，37℃孵育至 96h，收取尿囊液，尿囊液反 NDVShD-5-04株为发生一定变异 的强毒株，以期 复冻融 3次，8000r／min离心45min，上清于 4℃ 能解释本次非典型鸡新城疫的发病原因。 再 以27000r／min离心2h，收集沉淀，1：100倍 1 材料与方法 PBS悬浮沉淀 。取病毒浓缩液按 Trizol试剂说明书 1．1 病毒株、菌种和克隆载体 操作提取总 RNA。 NDV毒株为山东农业大学预防兽医学系微生物 1．4 NDVF基 因的RT-PCR及测序 中心实验室，2004年从山东潍坊某鸡场的不表现典型 1．4．1 引物 的设计与合成 根据 国外 已发表 的 新城疫症状的高抗体蛋鸡群中分离到的一株新城疫 DNVF基因序列，利用 Oligo5． Demer软件 自行设 毒株 (暂命名 ShD-5—0