食品卫生检测技术第05章.pptVIP

食品中微生物毒素的测定技术 （三）培养基和试剂 （1）肠毒素产毒培养基 成分： 蛋白胨20g、胰消化酪蛋白200mg（氨基酸）、氯化钠5g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、氯化钙0.1g、硫酸镁0.2g、菸酸0.01g、蒸馏水1000mL、pH7.2～7.4 制法：将上述成分混合于蒸馏水中，溶解后调pH7.2～7.4（如用固体透析培养法加入琼脂10～12g），121℃高压灭菌30min。 （2）A、B、C、D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。 （3）1％琼脂糖（0.9％生理盐水配制）溶液。 （4）0.2mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液。 食品中微生物毒素的测定技术 （5）三氯甲烷。 （6）6mol/L盐酸溶液。 （7）5mol/L氢氧化钠。 （8）生理盐水。 （9）1％乙酸溶液。 （10）0.1％噻嗪红R或氨基黑B。 （11）硅胶或凡士林。 （12）0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液。 （13）0.2mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液。 食品中微生物毒素的测定技术 （四）检验程序 微玻片法检测肠毒素（浓缩法层析法）程序见图5-1。 图5-1 浓缩法层析法 食品中微生物毒素的测定技术 （五）测定方法 1.提取 （1）直接浓缩法 取食品样品100g，加入无菌0.2mol/L磷酸盐酸缓冲液（pH7．5），均质成匀浆，置4℃浸泡18～24h，用纱布过滤，将滤液离心8000r/min20min；取上清液，放人分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，振摇10min，静置，将底层三氯甲烷弃去（如不分层，可8000r/min离心20min）。加入6mol/L盐酸溶液调pH至4．5，8000r/min离心20min，取上液，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH至7.5，离心，取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇上浓缩至l～2mL，做微玻片双向琼脂扩散。 食品中微生物毒素的测定技术 （2）层析法 如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馏水洗下，装入透析袋，以0．008mol/L磷酸盐缓冲液（pH5．6）平衡，加入CM层析柱内，流速l～2mL/min，用0．008mol/L磷酸盐缓冲液（pH5．6）洗脱，再用0．2mol/L磷酸盐缓冲液（pH6．8）洗脱出肠毒素。洗脱液装入透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至lmL，做微玻片双向琼脂扩散，检测肠毒素。 食品中微生物毒素的测定技术 2.测定 （1）微玻片法 将在95％乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干，吸取溶化的0.2％琼脂糖（蒸馏水配制）滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放无尘的环境中干燥。先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取l％琼脂糖，立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放人加有湿棉球的容器内，放25～30℃18～24h观察结果。可在灯光上，并对着暗的背景观察，在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。 食品中微生物毒素的测定技术 （2）玻片法 吸取溶化的l％琼脂糖2.5mL，铺在洁净载玻片上，凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成辐射型，孔距为2.5mm，中心孔加入肠毒素抗血清，周围6个孔加入菌株或食品的肠毒素提取液，放人有滴加2/10000三氮化钠湿棉球的容器内，以保持湿度。置25～30℃，18～20h，观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。 （3）染色法 用微玻片法取下胶带和有机玻璃模板，玻片法可直接将玻片放人蒸馏水中浸泡4～8h，中间换2～3次水，在下述各液中浸10min，10％乙酸中含l％噻嗪红R（或氨基黑）；l％乙酸；1％乙酸含1％甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35℃烘干。阳性者沉淀被染料颜色，可长期保存。 食品中微生物毒素的测定技术 3.结果判定 在菌斑和抗毒素孔之间出现沉淀者为阳性；无沉淀者为阴性。 二、酶联免疫法 （一）原理 酶标抗体与肠毒素特异结合，加人底物后发生显色反应。 （二）试剂 （1）肠毒素酶联免疫检测试剂盒，4℃冰箱保存。 （2）洗液 在一个塑料洗瓶内，用1L蒸馏水或去离子水稀释浓洗液（试剂1号）。 （3）样品添加剂 试剂2号。 食品中微生物毒素的测定技术 （4）阳性对照 使用前，试剂3号与洗液按1:100稀释，稀释时必须用聚丙烯塑料管。