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激光扫描共聚焦显微镜检测分枝杆菌与溶酶体融合的实验教学设计（三篇）

教案一：实验原理与细胞标记技术

课题名称

细胞内的隐秘战场：分枝杆菌与溶酶体融合的荧光标记检测

一、教学目标

知识目标

理解分枝杆菌与宿主细胞溶酶体融合的生物学意义

掌握荧光蛋白标记与溶酶体探针的原理（GFP/RFP标记、LysoTracker染色）

明确激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）的成像原理与检测优势

技能目标

能独立完成细胞培养与荧光标记操作

学会设置LSCM的激光激发波长与检测通道

素养目标

培养严谨的实验设计思维

建立微生物-宿主细胞相互作用的研究视角

二、教学重点与难点

重点：荧光标记方法的选择与参数设置

难点：溶酶体动态标记与分枝杆菌活菌标记的兼容性

关键点：通过对比实验理解标记技术对检测结果的影响

三、教学方法

讲授法、案例分析法、模拟操作法

四、教学过程

（一）背景导入：微生物感染的细胞战场（10分钟）

致病机制回顾

播放结核分枝杆菌感染巨噬细胞的电镜图片

提问：分枝杆菌如何逃避宿主免疫系统的清除？（引导：阻止溶酶体融合）

技术引入

对比普通光学显微镜与LSCM的成像差异

展示LSCM三维重构的溶酶体-细菌融合动态图

（二）核心原理讲解（25分钟）

荧光标记技术

课本原文（假设教材片段）：GFP基因可与分枝杆菌抗原基因融合表达，经488nm激光激发后发射绿色荧光；溶酶体特异性探针LysoTrackerRed在酸性环境中发出红色荧光，需设置561nm激发波长。

分析：

知识点：荧光蛋白标记的特异性、激发/发射波长匹配

实验设计：为何选择酸性敏感探针？（溶酶体呈酸性环境）

LSCM成像原理

讲解激光共聚焦的点扫描与层切功能

演示软件操作：如何设置Z轴扫描间隔（建议0.5μm）

（三）实验设计与操作演示（30分钟）

分组实验设计

实验组：GFP标记分枝杆菌+LysoTracker染色巨噬细胞

对照组：未标记分枝杆菌+溶酶体染色

关键步骤：①巨噬细胞培养与LysoTracker孵育（37℃，30min）②分枝杆菌感染（MOI=10，37℃共培养2h）③洗涤固定后LSCM扫描

仪器操作要点

强调生物安全：分枝杆菌需在BSL-2实验室操作

演示激光功率调节：避免细胞荧光淬灭（建议≤20%功率）

（四）互动交流环节

标记技术辩论赛（15分钟）

问题：为何不直接用透射电镜观察融合事件？荧光标记有哪些优势？

参考答案：电镜需固定样本（无法动态观察），荧光标记可实时监测活细胞融合过程

讨论流程：小组对比两种技术→代表发言→教师总结互补性

参数设置速答（10分钟）

提问：LysoTrackerRed的发射波长范围？GFP与RFP能否同时检测？

参考答案：发射波长577-602nm；可设置双通道分别检测（488nm和561nm激光）

五、教材分析

本课参考《医学微生物学实验技术》中病原-宿主相互作用检测章节，教材详细介绍了荧光标记原理，但缺乏LSCM操作细节。教学时需补充仪器参数设置指南，结合临床案例（如结核杆菌耐药性与溶酶体逃逸的关系）提升应用意识。

六、作业设计

基础作业：

绘制荧光标记实验的流程示意图

查阅文献：列举3种溶酶体标记探针及其适用场景

拓展作业：设计对照实验：验证某药物对分枝杆菌-溶酶体融合的影响

七、结语

通过荧光标记原理与LSCM技术的结合，学生掌握了细胞内动态过程的检测方法。后续实验可衔接Westernblot验证融合相关蛋白表达，形成完整的研究链条。

教案二：激光扫描共聚焦显微镜操作与图像采集

课题名称

微观世界的精准捕捉：LSCM在融合事件检测中的应用

一、教学目标

知识目标

掌握LSCM的硬件组成（激光器、扫描头、探测器）

理解图像分辨率与扫描参数的关系（像素大小、扫描速度）

明确生物样本制备的特殊要求（活细胞vs固定细胞）

技能目标

能独立完成LSCM的光路校准与参数优化

学会使用ZEN软件进行图像拼接与三维重建

素养目标

培养仪器精准操作能力

建立技术参数影响实验结果的科学思维

二、教学重点与难点

重点：LSCM的通道设置与聚焦调节

难点：活细胞长时间扫描的荧光保护策略

关键点：通过实际操作理解分辨率-扫描时间的平衡关系

三、教学方法

演示法、任务驱动法、小组协作法

四、教学过程

（一）仪器探秘：LSCM硬件解析（10分钟）

实物展示

展示LSCM主机（激光器、载物台、探测器）

对比普通荧光显微镜：为何共聚焦能消除非焦平面荧光？（讲解针孔光阑原理）

软件界面介绍

演示ZEN软件界面：通道设置、Z轴扫描、三维重建模块

（二）操作流程详解（