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2024-05-29 发布于北京
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CRISPRCas9技术构建小鼠模型

CRISPR小鼠实验

随着CRISPR在2013年的出现，一切都发生了变化（Congetal.,2013）！Haoyi第一次接触CRISPR是在他使用这项新技术设计小鼠模型时（Wangetal.,2013,Yanget

al.,2013）。和其他人一样，Wenning也着迷于CRISPR，并马上加以应用。他发现在实验中有75%的老鼠显示出了突变！本来很困难的实验居然一次成功了，这是不可思议的，但是也体现了CRISPR技术的“简单易操作”。

后来，他的经历被全世界许多人分享。最终，这项被命名为CRISPR，以其概念简单，使用简单，性能稳定而被熟知。在自然环境中，CRISPR-Cas9是细菌和古细菌中的获得性免疫系统。它已被重新用于真核生物的基因组编辑，使用最广泛的CRISPR基因组编辑系统来自S.pyogenes。而Streptococcusaureus中的另一种Cas9在编辑小鼠胚胎方面S.pyogenes的Cas9一样有效，并且由于其更小，所以更具优势（Zhangetal.,2016）。为了编辑基因组，CRISPR/Cas系统使用了3种成分，一种约125nt的guideRNA（gRNA）用于指定靶点；一种在靶点位置产生DNA双链断裂（DSB）的Cas9核酸内切酶以及一种供体寡核苷酸或质粒修复模板（用于敲入模型）。

用CRISPR建立小鼠模型的基础

为了建立小鼠模型，将gRNA、Cas9和供体寡核苷酸或质粒组分聚集在一起，并显微注射到小鼠受精卵的细胞核或细胞质中。或者为了避免体外处理胚胎，可以将这些成分电穿孔到怀孕雌鼠的输卵管中，这项技术称为通过输卵管核酸传递或GONAD（Gurumurtyetal.,2016）。当然，AAV也可用作载体，通过注射到卵母细胞或怀孕雌鼠的输卵管中递送CRISPR/Cas9系统（Yoonetal.,2018,Mizunoetal.,2018）。或者可以将gRNA、Cas9和供体寡核苷酸电穿孔到小鼠受精卵中（Qinetal.,2015）。

当进入合子内时，gRNA将在小鼠基因组3x109nt的遗传物质中寻找其目标，Cas9酶将在目标位置切割。这时细胞会发出“SOS”信号，细胞修复机制会激活从而修复损伤。如果他们所能做的只是通过非同源末端连接（NHEJ）将两个断裂的末端“缝合”在一起，这将留下一个“疤痕”，在断裂的末端缺失或添加核苷酸，从而敲除基因。然而，如果提供修复模板（以寡核苷酸或质粒的形式），可以通过同源定向修复途径（HDR）在基因组中进行精确修复，例如单核苷酸改变、插入报告基因，还是用人类基因替换小鼠序列。