酵母双杂交系统检测蛋白质的研究进展.docxVIP

酵母双杂交系统检测蛋白质的研究进展 1989年，伦琴提出并建立了一种新的遗传方法，以直接检测母系细胞中的蛋白质相互作用。这一技术在细胞周期与分化、细胞凋亡、信号转导、癌基因产物功能、基因表达调控及蛋白自身特性等研究领域, 受到越来越多的关注。随着该技术的发展和研究的深入, 衍生出酵母单杂交、三杂交、反向双杂交等体系。其应用范围扩展至蛋白质与蛋内质、蛋白质与DNA、RNA及与其它小分子相互作用的研究, 对新作用蛋白的发现, 蛋白间相互作用网络的认识, 甚至对整个蛋白质组 (proteome) 的研究起到巨大推动作用。 1 经典的双重均混合系统 1.1 抑制剂序列的激活 酵母双杂交系统的建立基于对真核生物调控转录起始过程的认识。参与这一过群的转录激活因子在结构上是组件式的 (modular) , 往往由两个 (或两个以上) 相对独立的结构域组成, 即DNA结合结构域 (binding domain, BD) 和转录活化结构域 (activition domain, AD) 。两结构域建立空间联系是转录激活的关键, 而单独作用无法激活转录过程。 分别将拟研究的猎物 (prey, 或称靶蛋白) 蛋白的基因与编码AD的序列结合, 诱饵 (bait) 蛋白的基因与编码BD的序列结合, 形成两段融合基因。当两段融合基因通过载体质粒转入同一酵母细胞表达时, 分别生成融合蛋白prey-AD与bait-BD。借助诱饵蛋白与靶蛋白在核内的相互作用, 分离的AD与BD在空间上得以接近, 形成完整的有活性的转录因子, 进而与上游激活序列 (upstream activating sequence, UAS) 结合, 激活相应报告基因 (report gene) 获录。反过来, 报告基因的表达与否, 可判断靶蛋白与诱饵蛋白之间是否相互作用。通过简单的酵母遗传分析, 对报告基因进行检测, 即可实现对蛋白间相互作用的分析。 1.2 真核酵母模型 (1) 采用酵母作为报道株, 菌株生长速度快, 步骤简洁, 容易操作。 (2) 敏感度高。许多微弱或短暂的蛋白之间的相互作用, 借助报告基因表达过程中多级放大效应反映出来。 (3) 在真核酵母活细胞内进行, 蛋白易于保持天然折叠状态, 更接近体内真实水平。 (4) 酵母有许多营养缺陷标记, 结果易于筛选。 (5) 应用范围比较广泛。 1.3 基因治疗中蛋白间相互作用的检测 (1) 寻找与靶蛋白相互作用的蛋白, 尤其是筛选cDNA文库。 (2) 特异地检测已知蛋白间相互作用。 (3) 确定蛋白相互作用的部位甚至关键氨基酸。 (4) 确定蛋白之间弱相互作用。 (5) 确定基因治疗中多肽类药物作用机制。 (6) 建立蛋白相互作用图谱。 2 母乳喂养系统的不足和对策 2.1 蛋白质作用系统 融合蛋白必须转至核内才能活化转录, 这是影响双杂交系统进一步推广的主要障碍。对于胞外受体-配体作用, 以及需要核外加工修饰等翻译后介导的蛋白质作用而言, 该系统应用受到限制。一般而言, 膜蛋白也不适于此, 已出现通过改变某些细胞膜定位序列, 在载体中添加核定位信号序列的方法以及专门研究非核内蛋白作用的系统。 2.2 菌株的筛选和检测 指诱饵和靶蛋白在没有发生作用的情况下, 报告基因被激活。进行文库筛选时, 这是最常见的干扰实验准确性的问题。 (1) 靶蛋白本身含转录活化成分 (如可结合报告基因上游DNA) , 即prey-AD自身可激活报告基因转录。 (2) 诱饵蛋白本身有激活作用。对以上情况, 可通过严格对照实验, 排除假阳性。对诱饵和靶蛋白分别作单独活性报告, 不失为一好方法。 (3) prey-AD对bait-BD无特异性, 与无关的DNA结合域杂交体共转化酵母亦表现阳性。在筛出阳性克隆后, 将Prey-AD与无关DNA结合域杂交体作共转化酵母测试, 以排除假阳性。Harper采取一种快速鉴别假阳性的方法:用选择性培养基去除阳性克隆的bait-BD质粒, 只剩prey-AD质粒, 与不同性别的含无关DNA结合域杂交体的酵母交配, 以二倍体酵母是否表现阳性来鉴别假阳性。省去了回收质粒共转化酵母的烦琐步骤。 (4) 由于未被发现的调控途径激活报告基因, 这种假阳性需用其它实验排除。 (5) 假阳性也可能是双杂交设计的原因:cDNA库的构建中, 如使用随机引物, 可能使蛋白中一些非暴露区域暴露, 并被筛选出来;一对不在同一时间、同一种组织表达的蛋白可能发生作用, 而不是生理意义上的作用。 (6) 某些蛋白是依赖于遍在蛋白的蛋白酶水解途径成员, 它们具有普遍蛋白间相互作用能力。可判定相互作用的特异性并增大蛋白信息量, 有助于去除假阳性结果;将报告基因整和到染色体上, 可使基因表达水平稳定, 消除因质粒拷贝数变动对结果的影响。另外, 可用免