生化-4DNA的紫外分光光度法定量测定-HZJ.pptVIP

实验四 质粒DNA的琼脂凝胶电泳DNA的紫外分光光度法定量测定 何振健 讲师 Zhenjian He, Ph.D, Lecturer 生物化学与分子生物学技术 一、重组质粒的酶切鉴定（琼脂糖凝胶电泳） 二、紫外分光光度法检测DNA含量 实验安排 DNA琼脂板倒胶 质粒DNA电泳（约1h） （10 μl）酶切操作、保温（1-3h） 质粒DNA提取原理与方法 质粒DNA提取实验操作 ( 约90m) 纯化的质粒DNA（20μl） 琼脂糖凝胶染色及结果观察 第五周 第六周 具体实验步骤 1、灌胶或倒胶； 2、胶凝固后，小心垂直向上拔出梳子，将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2 mm； 3、加样：每排第一个孔加 DNA marker 10 μl （最后加） （酶切组：酶切质粒20ul，加入4μl loading buffer，混匀上样） (对照组：用酶切前的质粒10ul，加入2μl loading buffer，混匀上样，每组1个)； 4、接通电源，开始电泳（100V，60min）; 5、将凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的DNA条带。 取酶切产物全部上样 1 4 3 2 5 6 7 1.5%胶，电泳（100V, 60min） 1：Marker 2：待测样品1 3：待测样品2 4: 待测样品3 5: 待测样品4 6: 待测样品5 7：待测样品6 DNA琼脂糖凝胶电泳 紫外灯下观察结果 实验结果的分析 OC 型质粒DNA 点样孔 细菌基因组DNA L型质粒DNA SC 质粒DNA 细菌RNA 质粒电泳图谱 Relaxed circle Super-coiled form 重组质粒 BamHI Hind III 双酶切 电泳检测 5-G A A T T C-3‘ 3-C T T A A G-5 BamHI 5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III 电泳结果分析 目的基因片段256bp 载体3.4kb 100 1000 1500 200 300 400 500 600 700 800 900 M 3 2 1 4 5 M：Marker 1：酶切样品1 2：酶切样品2 3：酶切样品3 4：酶切样品4 5：未酶切质粒 2000 3000 5000 常见问题 1、提取的DNA不纯： 变性不充分；关键过程反应时间过短； 离心时间或速度不够。 2、提取的DNA成涂布状： 操作过程中用力过猛，动作粗暴； 操作系统有污染。 3、与染色体DNA分离不全： 变性过程不完全； 二、DNA的紫外分光光度法定量测定 分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。 特点 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6mol/L 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差1～2％ 操作简便快速 应用广泛 光学原理 光的本质是电磁波，既有波动性，又有微粒性。 c 光的速度 ? 频率 ?＝c / ? ? 波长 电磁波谱 远紫外 近紫外 可见 近红外 中红外 远红外 (真空紫外) 1nm ~200nm 200nm ~400nm 400nm ~ 780nm 760 nm ~ 2.5-3?m 2.5-3 ?m ~25-40?m 25-40?m ~1000?m 氢灯 复合光 (阳光及钨灯) 发射光谱 红 橙 黄 绿 蓝 靛 紫 单色光 三棱镜 可见光分光光度计光源 紫外分光光度计光源 分光光度法——光学原理 吸收光谱 光源透过某种物质的溶液，其发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。 入射光 透射光 反射光 被物质吸收的光 透光度百分比(transmittance,T) 光密度(optical density,OD) 吸光度(absorbance,A) 苯和甲苯在环己烷中的吸收光谱 苯(254nm) 甲苯(262nm) A ? 230 250 270 光吸收基本定律: Lambert-Beer定律 It I0 b dx I I-dI s 朗伯定律(1760年) D=lg(I0/It)=kb 比尔定律(1852年) D=lg(I0/It)=kc D：光密度，即光被吸收的程度，又称吸光度(A)。 k：比例常