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核酸的物理化学性质 核酸的物理化学性质 PAGE / NUMPAGES 核酸的物理化学性质 第 15 章、核酸的物理化学性质 （上册 P502） 本章要点： 1、核酸的水解， 2、核酸的紫外汲取， 3、核酸的变性和复性本章的主要内容： （一） 核酸的水解： 全部糖苷键和磷酸酯键都能被水解。 1） 酸水解： 糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。 2） 碱水解： 磷酸酯键易水解， RNA 比 DNA 易水解，因为 RNA 核糖上有 2‘ - OH ，水解过程见 P502。 3） 酶水解： 为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。 核酸酶的分类： 按底物专一性分为 RNase（核糖核酸酶）和 DNase（脱氧核糖核酸酶） 。按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用 点在尾端）。 RNase：如牛胰核糖核酸酶 （ EC 2.7.7.16 ），内切酶， 作用位点为嘧啶核苷 （ Py） ‘ - 3 - 磷酸与其余核苷酸之间的连键。 限制性内切酶：为 DNase。 剪裁 DNA 的工具，可用于核酸测序和基因工程。 在细菌中发现，当前已找到限制性内切酶数千种。限制性内切酶常常与甲基化酶成对存在，自己酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因此可辨别和降解外源 DNA 。 断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文构造，正读反读同样） ，在特定位点两条链切断后形成粘尾端或平尾端。 限制性内切酶命名： 如 E. coR Ⅰ，第 1 个字母 E( 大写 ) ，为大肠杆菌 (E.coli) 属名的第一个字母，第 2、 3 两个字母 co （小写）为种名头两个字母，第 4 个字母 R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分别这一类酶的编号。 （二） 核酸的酸碱性质： 核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见 P505，拥有酸碱性。 因为 DNA 酸碱变性，使酸碱滴定曲线不行逆。 （三） 核酸的紫外汲取： 嘌呤环与嘧啶环拥有共轭双键，核苷和核酸的汲取波段在 240~290nm，最大吸 收值在 260nm 邻近（蛋白质最大汲取值 280nm）。 （ 1） 可用于测样品纯度（测吸光度 A ）： A260/A280  比值，纯  DNA  应大于  ，纯  RNA  应达到  ，若样品混有杂 关于纯样品， 从 260nm  的  A 值即可算出含量。  A 值为  1，相当于  50μ g/mL （ 2）  DNA 双螺旋，或 40μ g/mL 单链 DNA （或 RNA ），或 核酸的摩尔磷吸光系数 ε（ P）：为含有 1 克原子磷（ 处的吸光系数。 ε（ P） =  20μ g/mL 寡核苷酸。 ）的核酸在 260nm A ：汲取值， C：每升溶液的磷摩尔数， C=W/30.98 ， L：比色杯内径。 一般天然 DNA ε （P）为 6600， RNA 为 7700~7800 因为双螺旋构造使碱基对的 π 电子云发生重叠，使紫外汲取比单链减少， 由此可判断 DNA 能否变性。 DNA 变性时 ε （P）值高升，添色效应。 DNA 复性时 ε （P）值降低，减色效应。 核酸比所含核苷酸单体的 ε （ P）低 40~45% 。 （四） 核酸的变性、复性及杂交： （ 1） 变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变为单链，不波及共价键的断裂。 降解：多核苷酸骨架上共价键（ 3‘ ， 5‘- 磷酸二酯键）断裂，分子量降低。 惹起变性要素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形成氢键）。 DNA 变性温度：又称熔点或溶化温度，为 DNA 双螺旋构造失掉一半时的温度，用 T m 表示， DNA 的 T m 一般为 82~95 0C。 DNA 变性是迸发式的，变性在一个很窄温度范围内发生。 P508 图 14-4 为 DNA 变性过程。 影响 T m 的要素： 1. DNA 的均一性：均一则 T m 窄，如 poly (A - T) ， poly d(G - C)等， T m 窄。 G- C 含量： Tm 值与 G- C 含量成正比， G- C 含量越高， T m 值越高，因为 G- C 间三个氢键。 G- C 含量与 T m 关系的经验公式： G- C% = (T m - 69.3) × 可由 G- C 含量计算 T m 或由 T m 计算 G- C 含量。 3. 介质离子强度： 离子强度较高时， DNA 的 T m 值较高， DNA 较稳固，所以 DNA 的保留在 含盐（如 1mol NaCl ）缓冲溶液中。 RNA 的变性： RNA 分子中有局部双螺旋区，所以也可发生变性，不过 Tm 值 较低，且范围较宽 双链 RNA