第7章 荧光免疫技术课件.ppt

第七章 荧光免疫技术 荧光抗体技术 荧光免疫测定 均相荧光免疫测定（F/B不分离） （homogeneous fluorescence immunoassay） 非均相荧光免疫测定 （heterogeneous fluorescence immunoassay） 荧光免疫技术 荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏 感性相结合，对抗原或抗体进行定性、定位或定量检测。 荧光免疫技术的类型 荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定： 时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测定 均相荧光免疫测定： 荧光偏振免疫测定 自发荧光寿命短:1ns～10ns 镧系元素寿命长:10μs～1000μs 短寿命荧光完全衰变后再测定镧系 元素特异荧光 基本原理 时间分辨检测原理示意图 时间分辨 一、时间分辨荧光免疫测定 发射光谱带较窄：613nm±10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm～350nm，灵敏度高 基本原理 发射光谱和激发光谱 时间分辨荧光免疫测定 镧系元素 铕(Eu3+)（最常用） 钐(Sm3+) 铽(Tb3+) 钕(Nd3+) 镝(Dy3+) 标记物 1000 Dy3+-PTA 14 丹黄酰氯 714000 Eu3+-β-NTA 3.0 球蛋白 3.0 罗丹明B 96000 Tb3+-PTA 4.5 FITC 925000 Eu3+-PTA 3.5 细胞色素C 60000 Sm3+-PTA 4.1 人血清蛋白 65000 Sm3+ -β-NTA 1～10 非特异荧光背景 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 常见荧光物质的荧光寿命 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图 双抗体夹心法 固相抗体和Eu3+标记抗体与待检 抗原结合，形成固相抗体-待检 抗原-Eu3+标记抗体复合物，酸性增强液下，Eu3+解离，340nm激发光下发射613nm荧光。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗体竞争法 待检抗原和Eu3+标记抗原与固相抗体竞争结合,温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 方法类型 固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的Eu3+标记抗体，温育洗涤后在固相中加入荧光增强液,测定荧光强度，荧光强度与待检抗原含量成反比。 时间分辨荧光免疫测定 灵敏度高：最小检出量10-18mol/L 分析范围宽：4～5个数量级 标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化 易受污染，本底增高 方法评价 时间分辨荧光免疫测定 光线通过偏振滤光片后， 形成一个方向的平面光称 为偏振光。 偏振荧光(绿光,525nm～550nm) 偏振光(蓝光,485nm) 荧光物质 基本原理 二、荧光偏振免疫测定 抗原抗体竞争反应 AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱 待检抗原含量与偏振荧光强度成反比 荧光偏振免疫测定原理示意图 基本原理 荧光偏振免疫测定 方法评价 样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低 荧光偏振免疫测定 * * 第一节 概 述 荧光（fluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。 一、荧光的基本知识 发射光谱和激发光谱 发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。（激发时所用光谱） 激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。（激发后所得光谱） 荧光的基本知识 荧光效率 定义:荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率 计算公式: 荧光效率= 荧光的基本知识 荧光寿命 定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。 各种荧光物质的荧光寿命不同。 荧光的基本知识 荧光淬灭 定义:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、I-等 。 荧光的基本知识 荧光偏振 FH－FL P＝──────