课件：核苷酸代谢与遗传信息的表达.ppt

（二）基因工程的基本过程 1.目的基因的制备 方法：基因组DNA文库、制备cDNA文库 PCR、化学合成 2.选择载体：?外源DNA片段离开染色体是不能复制的。如果将外源DNA连接到复制子上，外源DNA则可做为复制子的一部分在受体细胞中复制。这种复制子就是载体。常用载体有质粒、噬菌体DNA、柯斯质粒载体和动物病毒载体等。 3.目的基因和载体连接：把目的基因和载体基因通过DNA连接酶共价连接成一个完整的重组体分子，即DNA分子的体外重组。 4.重组DNA导入受体细胞：外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA）后，需将其导入受体细胞。随着受体细胞的生长、增殖，重组DNA分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖 。 5.重组体的筛选：重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养板培养得到大量菌落或菌斑。筛选就是将带有目的基因的菌落鉴定、提取。 6.目的基因表达：是指经过转录和翻译合成蛋白质的过程。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。 三、常用分子生物学的实验技术 （一）探针技术 1、探针（probe)：以研究和诊断为目的，用于检测特定核酸序列的已知DNA或RNA片段 2、探针技术：利用分子杂交的基本原理：把已知的核酸探针和待测的DNA分子进行杂交，按照碱基互补配对的原则，能够和探针的互补序列由于标记被检出，并根据探针的已知序列推出待测DNA的碱基序列。 （二）印渍技术是将待测的核酸分子转移到固相支持物上的过程。 常用的印渍技术有DNA印渍技术。基本过程为：限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳→使DNA变性→变性的单链DNA从凝胶中按原来的位置和顺序转移到硝酸纤维膜上固定→和标记探针杂交→检测。 （三）聚合酶链反应技术（PCR技术） 目前，采用PCR获取目的DNA十分广泛，应用这一技术可以将微量的目的DNA片段在体外扩增100万倍以上。PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末端和3末端相互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到扩增。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、DNA聚合酶（具耐热性）、dNTP以及含有Mg2+ 的缓冲液。 PCR的基本反应步骤包括：1）变性——将反应系统加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；2）退火——将温度下降至适宜温度（一般较Tm低5℃）使引物与模板DNA退火结合；3）延伸，将温度升至72℃，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环，新合成的DNA分子继续做为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA片段的目的。 PCR的主要用途 目的基因的克隆、基因的体外突变、DNA的微量分析。 四、基因诊断与基因治疗 （一）、 基因诊断 基因诊断的常用技术方法 1、核酸分子杂交 2、聚合酶链反应(PCR) 3、DNA序列测定 基因诊断的应用 1、遗传性疾病 2、遗传易感性疾病 3、感染性疾病 4、肿瘤 5、法医鉴定和组织配型 （二）、 基因治疗 基因治疗的概念 基因治疗的基本程序 基因治疗研究的主要内容或策略 基因治疗的应用与展望 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * * * * * * * * * * * * * * 3. 通用性： 蛋白质生物合成的整套密码，从原核生物到人类都通用。 已发现少数例外，如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体等。 密码的通用性进一步证明各种生物进化自同一祖先。 （二）tRNA是转运氨基酸的工具 所有tRNA的二级结构均是三叶草形，其氨基酸臂的3′-CCA-OH是氨基酸的结合位点，反密码环顶端的反密码子与mRNA上的密码子配对结合。tRNA携带的氨基酸，是由mRNA上三联体密码决定的，因此，tRNA可将氨基酸准确地带到指定的位置。 tRNA与氨基酸结合生成氨基酰-tRNA tRNA与氨基酸的结合是在氨基酰-tRNA合成酶的作用下完成的。 氨基酸＋ATP＋酶 → 氨基酰-AMP-酶＋PPi 氨基酰-AMP-酶＋tRNA → 氨基酰-tRNA＋AMP＋酶 tRNA的反密码子与mRNA的密码子配对结合 反密码子与密码子结合时，二者的方向是相反的，如果都从5′端至3′端方向阅读，mRNA密码子的第一、二、三位碱基与tRNA反密码子的第三、二、一位碱基相对应。密码子的第一、二位碱基与反密码子的第三、二位碱基的配对严格遵循A-