课件：二蛋白质生工.ppt

双向电泳 在二维方向上对同一蛋白质样品先后进行两种不同性质的电泳，提高蛋白质电泳的分辨率。 先将蛋白质样品在一维方向进行等电点聚焦凝胶电泳，使蛋白质按等电点分离成条带；然后在换用SDS在二维方向电泳，使位于同一条带中的蛋白质按分子质量展开。 蛋白质的离子交换层析 与氨基酸的离子交换层析基本原理相同，流动相中的离子与固定相上可解离基团的可逆交换。 蛋白质所带电荷的种类和数目不同，与层析介质的结合力不同。首先用大量洗脱剂洗出未结合的杂蛋白，然后逐步提高洗脱剂离子强度（或改变pH），结合在凝胶上的蛋白质按照结合力从弱到强的顺序依次洗脱下来，分布收集洗脱液，即可获得分离的蛋白质。 根据蛋白质吸附特性分离蛋白质 利用介质表面的活性基团对流动相中不同组分吸附性能差异进行分离，当蛋白质颗粒接触到比表面积大的固体颗粒物质时，会受到表面基团的吸引而停留下来。 不同蛋白质分子表面的极性与非极性氨基酸残基的数目、比例及分布不同，与固体颗粒物质的吸附作用力也就不同。 根据生物分子特异亲和力分离蛋白质 首先将特异配基共价连接到惰性凝胶（如葡萄糖、琼脂糖）等颗粒上制成亲和层析介质。 当蛋白质混合物流经亲和层析介质，只有目标蛋白能与配基结合；用缓冲溶液洗脱除去未结合的杂蛋白，最后改变洗脱条件，把目标蛋白给洗脱下来。 蛋白质鉴定 蛋白质分子质量鉴定——SDSSDS（十二烷基硫酸钠）是蛋白质变性剂，可破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质发生变性；在β-巯基乙醇存在下，蛋白质二硫键断裂，多肽链充分伸展，SDS与蛋白质的侧链通过疏水作用形成复合体。SDS与大多数蛋白的结合比（质量比）是1.4:1，相当于2个氨基酸残基结合1分子SDS. SDS与蛋白质的结合，使蛋白质带上大量负电荷，原有的电荷差异可以忽略不计， SDS与蛋白质的结合，使蛋白质的构象变成椭棒状。 在SDS存在下，蛋白质在电场的泳动时其迁移率仅仅与蛋白质分子质量有关。 lgM=a-bμ M——蛋白质的分子质量 a，b为常数，μ 为蛋白质在凝胶中的迁移距离与指示剂前沿距离的比值。 在同一块电泳凝胶上对一组已知分子质量的标准蛋白质和蛋白质样品分别进行SDS-APGE，以标准蛋白的迁移率为横坐标，以蛋白质分子质量对数为纵坐标绘制标准曲线，从未知蛋白的迁移率即可求出蛋白质亚基的分子量。 蛋白质免疫印迹反应 A、蛋白质样品凝胶电泳分离，获得电泳胶。 B、在凝胶上平铺一层硝酸纤维素，在凝胶一侧加负极，在滤膜一侧加正极，将蛋白质从凝胶电转移到滤膜上。 C、先后加入特异性抗体和酶标二抗分别进行孵育结合。 D、洗脱除去非特异性抗体，利用二抗上结合的标记分子（辣根过氧化物酶）使目标蛋白条带显色。 蛋白质定量分析 双缩脲反应：由两分子尿素缩合成的化合物，分子中的两个CO-NH在碱性溶液中能与Cu2+反应生成紫红色络合物，称为双缩脲反应。 检测范围：1-10 mg/mL Folin-酚反应 在双缩脲反应基础上，再加入酚试剂（含磷钼酸和磷钨酸）进一步反应，蛋白质酪氨酸酚羟基能将酚试剂还原成蓝色化合物，灵敏度可提高一个数量级。 考马斯亮蓝结合反应 考马斯亮蓝含有6个苯环和2个负电荷基团，通过范德华力、疏水作用和静电力与蛋白质进行物理结合，结合后的考马斯亮蓝颜色发生变化，通过比色法可定量蛋白质。 考马斯亮蓝R-250灵敏度高，用于电泳凝胶上的蛋白质染色。 G-250用于定量溶液中蛋白质的浓度。 蛋白质纯度鉴定 SDS：电泳胶染色后仅一条带，说明该蛋白质样品达到了SDS的纯度。 SDS是变性电泳，对于由不同亚基组成的多聚体蛋白，即便是纯样品也会出现多条带。 即使SDS电泳胶上仅出现一条带，并不意味着只含一种蛋白质，如果对该条带进行二维电泳，有可能分离多个肽链。 凯氏定氮 紫外吸收 The end ! THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * 蛋白质或肽的氨基末端分析法之一。由埃德曼（P．Edman）所创立。即在弱碱性条件下使之与异硫氰酸苯酯反应，然后用酸处理，从多肽链上仅使氨基末端残基以氨基酸的苯基乙内酰硫脲衍生物的形态游离出来，然后进行分析。根据反应试剂或衍生物的缩写，本法亦称PTC法或PTH法。在第一个氨基末端残基游离后，对剩余的多肽链如适用于同一反应，则可游离出下一位置的残基。如此反复操作，有可能从末端决定氨基酸排列顺序，据此原理设计出来的氨基酸自动序列仪（amino acid sequenator）市场上已有出售，在对几种蛋白质一级结构的确定上发挥了威力。 * 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性a-碳原子，因此都具有旋光性. 分子