第三章 基因工程的常规技术PPT.ppt

一、基因芯片 基因芯片技术是指将大量寡核苷酸或DNA探针（与核酸分子杂交相反，亦称靶基因）按特定的排列方式固化在固相支持物表面，按碱基互补配对的原则，与标记的特异的单链DNA或RNA（待测样品）分子杂交形成双链，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品分子的数量和序列信息。 由于基因芯片上固定的探针可以是cDNA、寡核苷酸或来自基因组的基因片段，且这些探针固化于芯片上形成基因探针阵列，故基因芯片又被称为DNA芯片、DNA阵列、cDNA芯片、寡核苷酸阵列等 。 DNA芯片技术工作流程主要包括：芯片的制备、样品的准备与标记、杂交、信号检测和数据分析处理，其中最关键的是芯片的制备。 DNA芯片基本应用可分为两个主要方面：定量分析（主要指测序和突变检测）与定性分析（主要指对基因表达的研究）。 如： 1.DNA序列测定 2.突变及多肽性分析 3.基因表达分析 4.基因组研究 5.基因诊断 6.药物研究与开发 基因芯片杂交检测流程图 二、蛋白芯片 蛋白芯片是以蛋白质代替DNA作为检测对象。 其原理是将各种蛋白质有序的固定于某种介质的载体上成为检测的芯片，然后用标记了有特定荧光物质的抗体与芯片作用，与芯片上的蛋白质相匹配的抗体将与其对应的蛋白质结合，在将未与芯片上的蛋白质互补的抗体洗去之后利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，检测芯片上各点的荧光强度，在通过计算机分析蛋白质之间的相互关系以及基因表达功能等。 基因文库的基本概念 从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为： 基因组文库（含有全部基因） cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因） 第五节、基因文库构建 一、基因组文库 基本步骤: 1.分离基因组 DNA 2.DNA 的断裂 物理剪切 (包括吹吸、振荡和超声波）和限制性酶解 3.DNA 片断的分离与连接 4.包装，转染或者转化 二、cDNA 文库的构建 基本步骤： 1) mRNA 分离、纯化和分级分离 2) cDNA的合成 3) 与载体的连接 4) 转化 RNA提取流程－－ 样品前处理注意点 选择新鲜血液，不得超过4小时 选择新鲜的幼嫩组织 选择处于生长旺盛的时期收集细胞 选择新鲜组织，生长旺盛的组织 可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到的白细胞 然后加入一定量的TRNzol，-70℃保存较长时间 去掉培养基，加入一定量TRNzol -70 ℃保存较长时间 推荐使用专门的RNA样品 储存液进行储存 液氮或加入RNase抑制剂中保存， 避免反复冻融 RNA提取流程－－ 样品前处理中如何保存样本 引物的设计原则： 1.引物碱基G＋C含量以45%－55%为宜。 2.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 3.Tm值应高于55℃。 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定 PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃ 到70℃。 退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。 2个引物要有近似的Tm值，以免相差太大，引起非特异性扩增；一般退火温度为最高Tm值的引物温度减5℃. 4.PCR扩增的长度一般：2kb。 5.引物3’端碱基要求严格配对。 Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为TG＝CA。即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。 6.尽量减少自身配对。 7.避免两条引物互补。 8.引物要特异。 9.可以在引物的5’端加上合适的酶切位点。 一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。 引物的设计可以参照： 两分钟StepByStep学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件 核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版/ PCR技术讨论版 /cgi-bin/ primer/primer3_www.cgi ? 引物