分子生物学-10-1-G库教学讲义.pptVIP

5.2.6 基因组文库的构建 基因文库(gene library) 基因组文库(genomic library) cDNA文库(cDNA library) 1.起因：绝大多数基因难以直接分离得到 高等真核生物，基因组DNA十分庞大 基因可达数万个 基因组成结构复杂 编码序列 非编码序列 调控序列 间隔序列 重复序列 单个目的基因在整个基因组中所占比例极小 未知基因更难克隆 要分离的目的基因往往是未知基因 无法对它进行特异性扩增， 只能对所有的基因进行扩增， 构建基因文库 然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来 最后分离得到目的基因。 2. 克隆未知基因常用建库的方法 目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆 3.基因文库概念 又称DNA文库，是指某个生物的所有基因组DNA克隆的汇总 DNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落(或噬菌体)，所有菌落(或噬菌体)的集合即为该生物的基因文库。 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 6.基因组DNA文库的质量标准 一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件： 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序 克隆片段易于从载体分子上完整卸载 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选等后续操作 7.计算文库规模的公式 计算完全基因文库所需实际克隆数的公式N=ln(1-p)/ln(1-f) 式中，N是 所需克隆数；P为重组体群体中出现目的基因序列的几率；f为限制片段的平均大小与基因组DNA总量之比。例：大肠杆菌基因组大小为4.6×106bp,所克隆基因组DNA片段的大小为2 ×104bp，为使目的基因存在库中的概率为99%，该基因文库含有重组体克隆数应大于多少？? ? 解：N=ln (1-99%) / ln [1-(2 ×104bp/ 4.6×106bp)]=1.1 ×103 8.基因组DNA文库构建的程序 ①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞； ⑤重组克隆的挑选和保存。 4.DNA文库构建的程序 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的DNA（外源基因） 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的DNA 连接酶 重组体 转化 体外包装，转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 转化子 or 构建基因文库的基本程序 组织或细胞染色体DNA 基因片段 重组DNA分子 含重组DNA的转化菌 限制性内切酶 克隆载体 受体菌 ?1、利用质粒载体 构建小文库 该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。 BamHI MboI OH P OH HO 脱磷酸化 重组DNA T4 连接酶 转化E coli 基因组文库 总DNA HindIII BamHI SalI EcoRI PstI ScaI Tc Amp R pBR322 (4.36 kb) Ori HindIII EcoRI PstI ScaI R Amp R Ori SalI 挑单克隆 ?2、利用噬菌体 构建基因组文库 cos序列是lamda噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列 page171 page171