分子生物学-11-2-酵母杂交等讲解材料.ppt

2、免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 非特异结合的蛋白质 图6-26 缺少注解 3、GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和， 离心，沉降，分离，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 发生相互作用 不发生相互作用 P224 谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferase) 离心，沉降 Pull-Down Pull-down 试剂盒 4. 细胞内蛋白质相互作用研究—荧光共振能量转移法（FRET） FRET荧光能量转移有三个基本条件： （1）给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； （2）给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠（这是能量匹配的条件）； （3）给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光 谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量 没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不 同，可根据需要组成不同的探针对。常用的 探针有： 荧光蛋白，一类能发射荧光的天然蛋白及其 突变体。 传统有机染料，具有特征吸收和发射光谱的 有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。 镧系染料，金属染料。一般与有机染料联 用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检 测的准确性和信噪比。 5、Far Western blotting Far-Western 印迹：Far-Western印迹最初发明用于32P标记的GST-融合蛋白表达文库的筛选，现在则用于检测蛋白质-蛋白质相互作用。最近几年，Far-Western还用于检测受体-配体相互作用以及相互作用蛋白文库的筛选 谷胱甘肽转硫酶(Glutathione S-transferase) 第三版 Far-Western印迹技术与Western印迹十分相似，原理基本相同，检测手段和流程基本相同： 用SDS（十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）或非变性PAGE分离含有未知靶蛋白的样品（通常为细菌裂解液）然后转膜。靶蛋白附于转移膜表面时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵蛋白进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应后，运用该诱饵蛋白的特异性检测系统即可检测出相应条带。 蛋白印迹中封闭液的作用:是封闭未吸附蛋白的部位，以减少非特异性结合背景的影响。常用的封闭液有脱脂奶粉、小牛血清等 第三版 Far-western blotting与western blotting的区别 Far-western blotting is a molecular biological method which is based on the technique of western blotting. While usual western blotting uses an antibody to detect a protein of interest, far-western blotting uses a non-antibody protein, which can bind the protein of interest. Thus, whereas western blotting is used for the detection of certain proteins, far-western blotting is rather employed to detect protein:protein interactions. 第三版 L L Gel Labled “bait” protein with non-antibody protein “L” 1. 细胞蛋白质电泳 转膜 2.标记的诱饵蛋白与靶蛋白互作结合 3. 非放标记 3. 放射性标记 4.化学法光物质HRP与标记物抗体连接，CCD检测发光 4.放射自显影检测 L HRP light L membrane 诱饵 第三版 Far Western blotting Thermo Scientific Far-Western蛋白质相互作用试剂盒说明书 第三版 Far-western blotting 做激酶反应：保护未知蛋白 利用谷胱甘肽对Sepharose 4B柱的亲和，用于纯化目的蛋白 放射性标记反应：用于下一步检测未知蛋白 结果：两种不同类型细胞中表达的差异蛋白 同时在文库中找到该未知蛋白的基因 第三版 6.3.4 染色质免疫共沉淀 （chromatin immuno-