分子生物学-10-3-RNA操作知识讲稿.pptVIP

④ 将裂解液加到离心柱（淡紫色）上下接一个2ml收集管，最大转速离心 2min。裂解液通过柱子时被均质化，小心吸取上清液，转移到另一新离心管； 加入0.5倍体积（225 μl）96～100% 乙醇，混合均匀。加入乙醇后，可能会出现沉淀，无影响； 细胞碎片被阻留在柱子上，包括RNA在内的分子物质通过离心柱 所谓 均质化 将混合液全部（包括沉淀675 μl）转移到吸附离心柱（粉红色）内，下接2 ml的收集管，10000 rpm离心15秒。弃去管内液体； ⑦加入700μl RW1缓冲液，10000rpm转速下离心25秒，弃去收集管； ⑧将离心柱转移到一个新的2ml收集管上，加入500μl RPE缓冲液，10000 rpm离心15秒，弃去管内液体重复使用收集管； 加入500μl RPE到离心柱内，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管； ⑩把离心柱接在一个新的1.5 ml Eppen管上，加入30～50μl 无RNase水（0.1%DEPC处理），10000 rpm离心 1min，洗出RNA。若RNA产量在20μg以上，用30～50 μl无RNase水再洗脱1次。RNA样品保存于-20℃备用。 RNA的制备 分子生物学技术 讲义 郜刚 山西师范大学 生命科学学院 3D model of RNA molecule, with phosphate backbone (gray) and secondary structure (blue) 5.3.1 RNA提取概述 要了解生物某个器官或结构的功能和作用机理，一个重要的方式就是从分子角度去研究其功能基因的表达和调控，而分离得到高质量的RNA是进一步研究进行的首要条件,比如从植物组织中提取RNA是进行植物分子生物学方面研究的必要前提。要进行Northern杂交分析，纯化mRNA以用于体外翻译或建立cDNA文库，RT-PCR及差示分析等分子生物学研究，都需要高质量的RNA。因此，从植物组织中提取纯度高、完整性好的RNA是顺利进行上述研究的关键所在。　RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的,也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。 植物细胞内的RNA主要是 rRNA（占80～85％）、tRNA及小分子RNA（占10～15％）和 mRNA（占1～5％）。rRNA含量最丰富，由25S、18S和5S几类组成。mRNA种类繁多，分子量从数百至数千碱基不等，但绝大多数mRNA在3’端都有一个polyA尾巴，因此，可根据此特性用寡聚脱氧胸苷(OligodT)层析柱从总RNA中将 mRNA分离出来。一般情况下，提取的总RNA也可用于Northern blot试验。 RNA分析 通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA，但其中大部分为rRNA及tRNA，而mRNA仅占1%～5%。虽然mRNA大小和序列各不相同，但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多腺苷酸链。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。RNA分析其实是对组织细胞总RNA中的mRNA进行分析。 最常用的方法主要有:原位杂交、RT-PCR、Northern ,另外还有: Sl 核酸酶作图分析、引物延伸法等 RNA是一类极易降解的分子 在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。 防止RNA酶的污染 1.如果可能，实验室应专门辟出RNA操作区，离心机，移液器，试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期行除菌。 2.如果可能，在超净台中按照细胞培养的要求进行操作，可以有效避免操作中引起的RNA酶污染。 3.操作过程中应始终戴一次性橡胶手套，并经常更换，以防止手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带到试管或污染用具，尽避免使用一次性塑料手套。塑料手套不但常常造成操作不便，且塑料手套的多出部分常常在器具的RNase污染处和RNase-free处传递RNase，扩大污染。 4.避免在操作中说话聊天。也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。 5.尽量使用一次性的塑料制品，尽量避免共用器具如tips，tubes等，以防交叉污染。例如，从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H，T1等，在操作过程中极有可能造成移液器、离心机等的污染。而这些污染了的器具是RNA操作的大敌。 6. 关于一次性塑料制品，建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和t